【Science子刊】液体活检技术的飞跃：约翰霍普金斯大学的DNA甲基化异质性数字分析

【导读】癌症组织中的分子改变表现出细胞间遗传和表观遗传异质性，使诊断测定的性能复杂化，尤其是在早期癌症检测方面。传统的液体活检方法灵敏度和评估罕见外显子变异表观遗传异质性的能力有限，成本效益不高。团队报告了一种名为REM-DREAMing（Ratiometric-Encoded Multiplex Discrimination of Rare EpiAlleles by Melt）的方法，实现了低成本、并行化的逐分子异质甲基化模式分析，用于检测液体活检中的癌症。

2024年11月22日，美国约翰霍普金斯大学生物工程系Wang Tza-Huei教授团队在期刊《Science Advances》上发表了题为“Multiplex digital profiling of DNA methylation heterogeneity for sensitive and cost-effective cancer detection in low-volume liquid biopsies”的研究论文。在这项研究中，团队应用该平台同时评估了5个甲基化生物标志物的分子间表观遗传异质性，以改进基于血液的早期非小细胞肺癌筛查。在一组48例肺部结节不确定患者的低容量液体活检标本中，团队发现对分子间甲基化密度分布的评估，能显著提高多基因甲基化生物标志物面板在癌症早期筛查中的性能。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp1704

关于DNA甲基化

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DNA甲基化已成为检测早期癌症的极具吸引力的生物标志物。然而，由于甲基化模式本身会在整个基因组中逐渐演变，从而导致细胞间甲基化的高度异质性，因此，在早期阶段对DNA甲基化的评估可能会变得复杂。这些过程发生在癌症组织，其次是健康组织（如细胞周期或与年龄相关的表观遗传漂移），会降低诊断测定的临床灵敏度和特异性，尤其会削弱DNA甲基化生物标志物在早期癌症筛查中的效用。

在这项研究中，团队提出了一种名为REM-DREAMing（Ratiometric-Encoded Multiplex Discrimination of Rare EpiAlleles by Melt）的方法，它提供了一种简单而经济有效的方法，可在单拷贝分辨率下对分子间的外显子异质性进行高灵敏度的多重分析。研究结果表明，通过评估多基因组的分子间甲基化密度分布，可以显著提高传统甲基化评估技术的性能，临床灵敏度达到93%，临床特异性达到90%，接收器操作特征曲线 (ROC) 下的总面积 (AUC) 为0.96。

REM-DREAMing临床验证

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团队开发了一种五重REM-DREAMing液体活检测定，以DNA甲基化生物标志物的五基因面板为目标，该面板以前曾在NSCLC筛查中显示出良好的前景。在一项病例对照研究中，通过对低剂量CT扫描筛查出肺部结节的高危患者队列中的液体活检组织进行单倍实时甲基化特异性PCR（MethyLight）检测，临床验证了由5个基因（CDO1、TAC1、HOXA7、HOXA9和SOX17）组成的生物标志物面板。这项研究的结果证实，与无疾病或良性疾病患者的样本相比，NSCLC患者的cfDNA中更频繁地检测到这些位点的高甲基化。

五重REM-DREAMING验证

血浆中甲基化生物标志物的多重检测

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多元模型的结果大大优于任何单个标记物，临床灵敏度达到93%，临床特异性达到90%，总体AUC为0.96。能优化CDO1、TAC1、HOXA7和SOX17面板AUC的甲基化密度临界值，与之前发现的各标志物的临界值相同。但是，HOXA9组合的最佳甲基化密度阈值现在从重度甲基化（90%）转变为中度甲基化（50%）。对于该试验队列，五重REM-DREAMing平台的诊断性能大大优于之前公布的基于单重MSP和多重数字MSP（mdMSP）的诊断性能。

单个生物标志物的诊断性能。

总结

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1. REM-DREAMing的技术优势：REM-DREAMing平台的关键优势是产生的丰富数据，可全面评估给定面板中感兴趣的生物标志物或基因座的表位分布，提高临床灵敏度。

2. 甲基化密度的评估：在单个DNA分子水平上评估甲基化密度有助于建立有效的阈值，克服各种背景来源的噪音。

3. 样本量减少：REM-DREAMing能以较小的样本量（如1毫升）获得多种生物标记物的富集数据集，而许多基于NGS的技术每次检测需要5毫升或更多。

4. 改进的数字化方法的临床实用性：REM-DREAMing检测法可以大幅减少不必要的侵入性和潜在危险的随访程序，改善CT扫描阳性患者的预后，降低医疗费用。

5. REM-DREAMing的局限性和未来改进：目前的平台存在局限性，需要改进以更好地应用于临床，如提高纳米孔密度或将更多模块集成到扩展设备中。

6. REM-DREAMing的诊断潜力：REM-DREAMing提供了一种简单、低成本的方法，通过同时评估单拷贝灵敏度下的外显子甲基化模式，全面剖析甲基化生物标志物扩展面板中的分子间甲基化异质性，有望成为早期癌症的常规筛查工具。

参考资料：

1.A. L. Mattei, N. Bailly, A. Meissner, DNA methylation: A historical perspective. Trends Genet. 38, 676–707 (2022).

2.S. B. Baylin, J. G. Herman, DNA hypermethylation in tumorigenesis: Epigenetics joins genetics. Trends Genet. 16, 168–174 (2000).

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