国自然「榜一」名不虚传，竟然还能联合铁死亡这么用

来源：好本子

血红素加氧酶-1 的高表达水平促进巨噬细胞衍生的泡沫细胞中的铁死亡并加剧斑块不稳定性

图源：Redox Biology

1、这项研究的目的是 探讨参与斑块进展的关键铁死亡相关基因（FRG）及其潜在的分子机制。 通过生物信息学分析、单细胞测序和免疫组化等表明了巨噬细胞血红素加氧酶-1（HMOX1）是参与斑块不稳定的关键 FRG；

2、这项研究的 创新之处 在于：①发现铁死亡在 MDFCs（巨噬细胞衍生的泡沫细胞）的细胞毒性中起关键作用，并且是由缺氧应激介导的，Hmox1 的高表达水平诱导 MDFCs 铁死亡并加剧斑块不稳定；②探究了诱导巨噬细胞铁死亡的潜在机制：在缺氧下由于 Egln3 降解而导致的 Hif1a 稳定激活了 MDFCs 中 Hmox1 的转录，随后驱动铁死亡。

研究背景

斑块破裂伴随血栓形成是急性心血管事件的主要原因，在此期间，巨噬细胞死亡是一个标志。铁死亡是早期和晚期动脉粥样硬化之间的关键中间环节。现有证据表明巨噬细胞铁死亡与斑块脆弱性有关; 然而，确切的机制仍然难以捉摸。

研究思路

研究结果

1. 鉴定巨噬细胞 HMOX1 是斑块失稳的关键 FRG

为探索斑块进展的潜在机制，研究者们通过 GSE163154 和 GSE28829 数据集分析了稳定斑块和不稳定斑块之间的差异生物学特征。从 GSE163154 中鉴定出的 DEGs 主要参与了炎症反应，并激活了铁死亡途径。同样，在易损斑块中观察到更大的免疫浸润。进一步的单细胞测序分析显示，HMOX1 主要在巨噬细胞中表达。免疫组化染色也证实了在不稳定斑块的巨噬细胞丰富区，HMOX1 的表达增加，并伴有斑块破裂，脂质沉积增加，胶原体积增加。基于上述研究结果，假设低氧应激可以诱导亚铁细胞 HMOX1 的表达，随后激活巨噬细胞铁死亡。

图 1 巨噬细胞 Hmox1 是参与斑块失稳定的关键 FRG 的鉴定

2. 缺氧可上调 MDFCs 中 Hmox1 的表达并激活铁死亡

接下来通过 GSE16099 数据集进一步研究了缺氧对巨噬细胞的影响。在常氧组和缺氧组之间发现了 DEGs，在缺氧处理的巨噬细胞中，HMOX1 的表达显著上调。GO 和 KEGG 的分析结果如图 2A 所示。用 ox-LDL 处理 BMDMs，诱导 MDFCs，结果未能观察到暴露于常氧或低氧条件下的巨噬细胞中 Hmox1 表达的差异。然而，在缺氧条件下，MDFCs 中 Hmox1 的表达水平显著升高。此外，缺氧抑制了 MDFCs 的活力，但对巨噬细胞无显著影响。为验证铁死亡是否在缺氧介导的细胞死亡中发挥重要作用，研究者们用各种细胞死亡抑制剂治疗 MDFCs。

研究结果显示，细胞凋亡和坏死抑制剂没有发挥保护作用，而抑制铁死亡对缺氧介导的细胞失活有保护作用。如图 2E 所示，缺氧导致 MDFCs 中 GSH/GSSG 比值显著降低，同时铁含量和脂质过氧化水平显著增加，而这在巨噬细胞中没有观察到。上述研究结果表明，铁死亡在 MDFCs 的细胞毒性中起着关键作用，并且是由缺氧应激介导的。

图 2 缺氧促进 MDFCs 中 Hmox1 的表达并驱动铁死亡细胞

3. 高水平的 Hmox1 可促进 MDFC 的铁死亡，并加剧斑块的不稳定

用 Hmox1 过表达载体（oeHmox1）转导的 MDFCs 显示 Hmox1 表达显著增加，Gpx4 表达降低。高水平的 Hmox1 诱导铁死亡细胞死亡，其特征是 ROS 过量产生、铁保留增加和脂质过氧化。此外，由于 HMOX1 与免疫浸润呈正相关，研究者旨在识别相关基因，并探讨其潜在的机制，GSE163154 和 GSE28829 中上调和下调的前 20 个基因如图 3D 所示。热图强调了 C-C 基序趋化因子配体（CCLs）和基质金属蛋白酶（MMPs）的重要性。

相关分析显示，HMOX1 与 ccl 和 MMPs 呈正相关，Hmox1 过表达促进了 Ccl3、Ccl4、Ccl19 和 Mmp9 的产生。为了研究过量的 Hmox1 水平是否对斑块稳定性有害，研究者们使用高剂量的 AAV2/9-F480-m-Hmox1-ZsGreen3 喂养 ApoE-/-小鼠。动物实验结果显示，与对照组（AAV-Con）相比，Hmox1 的高表达加重了头臂动脉的斑块负担。虽然两组间胶原体积无显著性差异，但 AAV-Hmox1 组的斑块病变表现为易破裂的特征，脂质沉积增加。

图 3 Hmox1 过表达导致铁死亡细胞死亡，并加剧斑块的不稳定性

4. Hif1a 在 Egln3 降解条件下的稳定促进了 Hmox1 的转录

接下来对暴露于缺氧的 MDFCs 中进行了 RNA-seq，并将 Egln3 鉴定为候选基因。GSEA 一致显示，在缺氧处理的 MDFCs 中，HIF-1 信号通路和铁死亡通路被激活。Western 结果显示缺氧条件下 Egln3 表达降低，Hif1a 和 Hmox1 活性增加。同样，Egln3 沉默通过诱导铁死亡促进细胞内 Hif1a 的积累，并上调 Hmox1 的表达。为了了解 HIF1A 影响 HMOX1 表达的机制，用 HIF1A pcDNA3.1 和 HMOX1 启动子-报告基因质粒共转染 293T 细胞。

结果表明，HIF1A 增强了 2000 bp、1500 bp、1300 bp、1000 bp 和 100 bp 启动子的活性，表明 HIF1A 的结合位点可能位于 HMOX1 启动子区域的 100 bp 范围内。该结合位点的突变显着抑制了 HIF1A 激活的荧光素酶活性。Hif1a 与 Hmox1 启动子的直接结合也通过 ChIP 分析验证了。

图 4 缺氧诱导因子（Hif）1a 在 Egln3 降解条件下的稳定促进了 Hmox1 的转录

文章小结

总之，这项研究结果表明了：①Hmox1 的作用是水平依赖性的，Hmox1 的过度药理学诱导会驱动 MDFCs 中的铁死亡氧化应激；②缺氧条件诱导 MDFCs 中的 Hmox1 过表达，这加剧了铁死亡细胞死亡并影响了斑块稳定性；③Egln3 降解介导的 Hif1a 稳定化增加了 Hmox1 活性；④高 Hmox1 表达水平对 MDFCs 活力和噬菌斑稳定性有害，为动脉粥样硬化的管理提供了参考。

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