突破/陈列平课题组揭示免疫学老兵CD8a的新角色

2019的拉斯克基础医学奖（2019 Albert Lasker Basic Medical Research Award）颁给了Max Cooper和Jacques Miller教授，奖励他们分别发现免疫系统的B细胞和T 细胞。

1961～1962年，Jacques Miller 教授用他自学的婴儿胸腺（Thymus）切除术首次证明了胸腺器官不是当时医学界认为的可有可无的多余器官，如果婴儿小鼠胸腺被手术切除，成年后的小鼠外周淋巴器官体积大大减小【1】， 而且缺少负责免疫排斥的杀伤性细胞【2】。Jacques Miller 被免疫学界公认为是T （Thymus 的第一个字母）细胞的发现者。Jacques Miller 教授在后续的工作也发现胸腺来源的T细胞既具有杀伤性功能也具有帮助B细胞产生抗体的功能。但他并没有进一步深究哪一群T细胞具有杀伤性，哪一群T细胞具有帮助性。

1975年，Herbert Oettgen，Lloyd Old，Edward Boyse, 和Havey Cantor四位教授揭示CD8a+CD8b+ （又叫Ly2+Ly3+）的T细胞具有杀伤性功能，而CD4+ (又叫Ly1+) 的T 细胞具有帮助B细胞抗体反应和帮助杀伤性T细胞的功能【3-6】。从此，CD8a或者CD8b 被认为是杀伤性T细胞的标记分子，而CD4被认为是帮助性T细胞的标记分子。

1988年，Dan Littman 教授证实CD8a分子的胞外区可以结合MHC-I【7】。同年，Joseph Bolen 教授发现CD8a分子的胞内区可以结合Lck【8】。于是，CD8a 分子不仅是一个标记分子，免疫学界认为CD8a分子可以作为TCR的共受体而增强CD8+ T 细胞的反应。很多体外实验支持CD8a分子的共受体假说，但是缺乏体内实验的直接支持。CD8a分子在体内的功能有待阐明。

1991 年， Tak Mak 教授试图研究CD8a分子在体内的功能，于是设计出CD8a 基因敲除小鼠，发现CD8a基因对杀伤性T细胞在胸腺中的发育和阳性选择非常关键，杀伤性T细胞无法在CD8a–/– 小鼠胸腺中完成正常发育和阳性选择，导致CD8a–/– 小鼠外周淋巴器官中没有杀伤性T细胞【9】。于是CD8a基因在体内胸腺发育中的功能被阐明。但是外周淋巴器官中杀伤性CD8+ T细胞上CD8a蛋白的功能一直悬而未决，没有得到直接的体内试验阐明。

2022年，耶鲁大学癌症免疫中心主任，美国国家科学院院士，陈列平教授课题组在Science发表论文阐明了外周淋巴器官中杀伤性CD8+ T细胞上CD8a蛋白在体内的功能【10】。

该课题组运用CRISPR-Cas9技术设计出药物（tamoxifen）诱导型的条件性CD8a基因敲除小鼠。在没有药物（tamoxifen）诱导的条件下，该条件性CD8a基因敲除小鼠和野生型正常小鼠没有区别，杀伤性CD8+ T细胞在胸腺可以正常的发育和阳性选择，外周淋巴器官中充满杀伤性CD8+ T细胞。接下来，该课题组从条件性CD8a基因敲除小鼠的外周淋巴器官中分离出CD8+ T细胞，然后过继性转移到野生型小鼠中，药物（tamoxifen）注射受体小鼠会特异性敲除过继转移的CD8+ T细胞上的CD8a 基因。利用这一系统，可以特异性的研究CD8a基因在体内杀伤性CD8+ T细胞上的功能。他们的研究发现，药物诱导条件性敲除外周杀伤性CD8+ T 细胞上的CD8a会激活幼稚型或者记忆型杀伤性CD8+ T细胞，同时减少幼稚型或者记忆型CD8+ T细胞的存活，进一步的研究表明CD8a缺失引起的T细胞减少可能是T细胞活化引起的细胞程序性凋亡。值得一提的是，作者检查了TCR信号通路下游分子，发现CD8–/– T细胞的TCR信号减弱，所以CD8a缺失引起的细胞活化并不是TCR通路介导的。

为了证实药物诱导型CD8a基因敲除的发现，作者做出了CD8a的单克隆抗体，发现CD8a的单克隆抗体注射到小鼠中，也可以激活外周CD8+ T 细胞，为了排除抗体Fc的depletion效果，作者测序出CD8a的单克隆抗体的序列，并用高压注射的方法在小鼠体内表达CD8a的单克隆抗体的Fab片段，发现Fab片段也可以激活幼稚型和记忆型CD8+ T细胞和减少CD8+ T细胞的存活。

接下来，作者从含有大约6000种膜蛋白的蛋白库中找到了人类CD8a蛋白的配体PILRa, 并且可以用流式和ELISA的方法确认，同时CD8a-PILRa的相互作用在小鼠中是保守的。作者发现CD8a的单克隆抗体或者Fab片段都可以阻断CD8a-PILRa的相互作用，说明他们在体内的功能可能是由于阻断了CD8a-PILRa的相互作用。

PILRa是高表达在髓系细胞上的膜蛋白，作者同时也做出了PILRa的单克隆抗体去阻断CD8a-PILRa的相互作用。在小鼠体内注射PILRa的阻断抗体，发现也可以激活幼稚型和记忆型CD8+ T细胞和减少CD8+ T细胞的存活。作者还利用CRISPR-Cas9技术生产了PILRa 基因敲除小鼠，发现年轻时的PILRa基因敲除小鼠外周幼稚型或者记忆型CD8+ T细胞没有变化，但在年龄到达一年时，PILRa基因敲除小鼠的外周记忆型CD8+ T细胞显著下降。作者假设可能是PILRa分子另外的受体中和了PILRa-CD8a的抑制性信号，导致PILRa基因敲除小鼠到一年时才出现部分表型。

近二十年来，免疫学界对幼稚型和记忆型CD8+ T细胞在外周存活的详细研究表明MHC-I 和IL-7 负责幼稚型CD8+ T细胞的存活信号，而记忆型CD8+ T细胞只需要IL-7和IL-15提供存活信号。该研究表明PILRa–CD8a通路介导的细胞稳态静息也是幼稚型和记忆型CD8+ T细胞存活的重要机制。像很多原创性文章一样，这篇文章阐明了很多问题，同时也开启了很多新的问题。比如由于分泌性PILRa在小鼠血清中检测不到，说明髓系细胞–CD8+ T细胞之间的细胞-细胞相互作用对于维持CD8+T细胞的稳态静息很重要，这种髓系细胞– CD8+ T细胞的相互作用除了PILRa–CD8a通路以外，还有没有其他的膜蛋白分子通路？又比如，该文发现CD8a缺失诱导的T细胞活化不是TCR通路提供信号，那么是哪种通路在提供激活信号？回答这些新问题将进一步帮助我们理解认识T细胞。

陈列平院士为该文通讯作者，郑伶华博士为该文第一作者。第一作者郑伶华博士和第二作者韩雪博士已在俄亥俄州立大学Pelotonia 免疫癌症研究所成立两个独立实验室, 将继续围绕 T 细胞的基础免疫学和免疫治疗（肿瘤免疫，自身免疫病）开展前沿探索，并重视临床转化研究，欢迎博士生，博士后，访问学生/学者加入。

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https://doi.org/10.1126/science.aaz8658

制版人：十一

参考文献

1. Miller, J.F., Immunological Function of Thymus.Lancet, 1961. 2(720): p. 748-&.

2. Miller, J.F.A.P., Effect of Neonatal Thymtomy on Immunological Responsiveness of Mouse.Proceedings of the Royal Society Series B-Biological Sciences, 1962. 156(964): p. 415-+.

3. Kisielow, P., et al., Ly Antigens as Markers for Functionally Distinct Subpopulations of Thymus-Derived Lymphocytes of Mouse.Nature, 1975. 253(5488): p. 219-220.

4. Shiku, H., et al., Subpopulations of Cytotoxic T Cells with Different Surface Phenotypes.Proceedings of the American Association for Cancer Research, 1975. 16(Mar): p. 67-67.

5. Cantor, H. and E.A. Boyse, Functional Subclasses of T Lymphocytes Bearing Different Ly Antigens .1. Generation of Functionally Distinct T-Cell Subclasses Is a Differentiative Process Independent of Antigen.Journal of Experimental Medicine, 1975. 141(6): p. 1376-1389.

6. Cantor, H., et al., Characterization of Subpopulations of T-Lymphocytes .1. Separation and Functional Studies of Peripheral T-Cells Binding Different Amounts of Fluorescent Anti-Thy 1.2 (Theta) Antibody Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter (Facs).Cellular Immunology, 1975. 15(1): p. 180-196.

7. Norment, A.M., et al., Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules.Nature, 1988. 336(6194): p. 79-81.

8. Veillette, A., et al., The CD4 and CD8 T cell surface antigens are associated with the internal membrane tyrosine-protein kinase p56lck.Cell, 1988. 55(2): p. 301-8.

9. Fung-Leung, W.P., et al., CD8 is needed for development of cytotoxic T cells but not helper T cells.Cell, 1991. 65(3): p. 443-9.

10. Zheng, L., et al., The CD8alpha-PILRalpha interaction maintains CD8(+) T cell quiescence.Science, 2022. 376(6596): p. 996-1001.

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