疫苗前沿 | mRNA传染病疫苗最新综述
导读：疫苗的接种是疾病控制、缓解的重要手段。然而，目前已获许可的一些疫苗无法稳健诱导机体产生广泛的保护以及持久的免疫反应，且生产困难、耗时，这凸显了进一步改善疫苗的必要性。
mRNA疫苗是疫苗学领域新秀，目前研究已经解决了体外转录(In vitro-transcribed, IVT)的基本障碍，其主要特点有抗原设计灵活、可快速迭代筛选最佳免疫原、短时间内实现大规模生产。2024年10月，宾大团队在Nature子刊详细梳理了传染病mRNA疫苗的最新进展。今天由菌菌带领大家走进这篇综述。
01
不同mRNA平台概述
1.1 线性mRNA平台
普通的线性mRNA主要由CureVac AG开创，已有数十年的疫苗研究测试，被证明是一种有效的传染病疫苗。目前，普通mRNA序列中会引入某些修饰核苷用以增加蛋白质的产生、降低先天免疫反应。mRNA的关键考量点是其半衰期、稳定性、可翻译性和炎症能力，这些特征会影响mRNA疫苗的有效性和安全性。上述问题可以通过优化mRNA的结构元素5′cap、5′-UTR、CDS区、3′-UTR、poly(A)尾来得到改善（图1）。其中非编码元件、UTR、5′cap和poly(A)尾都有助于mRNA的稳定性，并在翻译起始中起关键作用。截至目前，cap1(m7GpppNm)是使用最广泛的帽类似物，其蛋白翻译量明显高于cap0，可以在IVT过程中直接使用帽类似物进行一步法加帽，也可以使用病毒加帽酶转录后加帽。
不同的5’UTR序列可能适用于不同的编码序列、不同的物种、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可随时联系菌菌：133 8033 2910。
同时，根据报道增加鸟嘌呤和胞嘧啶含量通常关联于更高水平的表达。此外，降低mRNA的免疫原性也是疫苗研发的关键，可采用的方法有用假尿苷或N1-甲基假尿苷代替尿苷，从而降低尿苷依赖性免疫；并通过纯化或RNase III处理以去除dsRNA杂质以降低炎症能力。
图1 mRNA疫苗平台
1.2 saRNA平台
自扩增mRNA（Self-amplifying mRNA，saRNA）疫苗由于其复制能力，可以以较低剂量诱导保护性免疫反应，减少疫苗引起的不良反应事件并降低成本。saRNA的组成与mRNA类似，因此也可以开展相关的序列优化（图2）。最近，对saRNA疫苗的研究有了新趋势，就是利用双重载体系统（反式扩增mRNA，taRNA），其中目标抗原和复制酶被编码在不同的mRNA上。这种优化可以减少saRNA的长度，从而减轻RNA不稳定的问题，并且可以单独对两个不同载体进行优化。
耀海生物基于甲病毒VEEV来源的复制子序列，搭建了通用的saRNA转录载体，转录生成的saRNA在细胞内能够实现高水平、超长周期的蛋白表达。如感兴趣可随时联系菌菌：133 8033 2910。
图2 saRNA与circRNA疫苗平台
1.3 circRNA平台
越来越多的研究表明，环状RNA (circRNA)可充当基因海绵、细胞活性调节剂。circRNA通常是通过合成一个或多个前体线性RNA，然后通过化学或酶连接方法进行环化而产生的。它是一种封闭的RNA，没有5′cap和poly(A)尾，这种共价闭合结构使其能够抵抗核酸外切酶的降解，显著延长半衰期。通过改造circRNA载体、5'-UTR、3'-UTR或内部核糖体进入位点元件，可以实现circRNA的更好翻译。目前，circRNA广泛使用的最关键限制是生产问题，以及缺乏人类免疫原性和安全性数据。这主要是由于RNA环化效率低，且目前使用的circRNA不含修饰的核苷，可能会诱导较高的炎症水平。
02
mRNA递送、免疫机制与生产
早期的mRNA疫苗主要利用如基因枪、电转等物理方法进行递送，但在临床试验中效果并不佳。近年来，mRNA主要通过脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles, LNP）完成递送，其组分为磷脂、胆固醇、聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)和阳离子脂质4种。据报道，LNP本身也是有效的佐剂，可以诱导机体产生强大的免疫保护反应。此外，目前聚乙烯亚胺、树状聚合物/超支化聚合物树状结构、聚（胺-共-酯）等新的载体也开始陆续用于saRNA、mRNA的递送。mRNA疫苗的作用机制相对简单，肌肉注射编码一种/多种抗原的mRNA-LNP，表达出的编码抗原被各种不同类型细胞吸收，然后被免疫系统识别并触发免疫反应。根据剂量和类型差异，mRNA在体内持续数天或更长时间。
图3 肌肉注射后mRNA-LNP的分布情况
mRNA-LNP的制备流程通常包括序列合成、质粒的扩增与提取、线性化质粒模板的获得与纯化、IVT与mRNA纯化、LNP包封、灌装。具体为，合成编码目标mRNA的DNA模板，然后将其克隆到合适的mRNA生产质粒中。然后在适当的大肠杆菌菌株中扩增质粒，纯化得到质粒模板，IVT制备得到mRNA。加帽可以在在IVT过程中进行，也可以在下游步骤中进行。纯化mRNA的目的为，去除流产RNA以及DNA模板。此步骤中用于质量控制有DNA含量、蛋白质含量、dsRNA含量、内毒素含量等。纯化后的mRNA进行进一步的包封，得到mRNA-LNP。最终产品经过进一步测试（如粒径、PDI、包封率以及mRNA浓度和内毒素含量、冻融稳定性）。其他的检测还包括有，细胞转染进行抗原的表达测试以及效价/免疫原性检测。
03
传染病mRNA的研究进展
3.1 病毒疫苗
季节性流感一直是mRNA预防性疫苗的重要疾病领域。目前，Moderna、Sanofi、Pfizer等多家公司都有布局。目前，靶向多种抗原的多价mRNA季节性流感疫苗实验结果也陆续披露，可诱导广泛的免疫力。
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)会导致婴儿、幼儿、老年人和免疫功能低下者患上严重的呼吸系统疾病。2024年6月，Moderna公司宣布FDA已批准RSV-mRNA疫苗mRESVIA上市，是首款以单剂量预充式注射器供应的RSV疫苗，用于保护60岁及以上成年人免受RSV感染。
人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus 1, HIV-1)是最具挑战性的疫苗靶点之一，因为它具有遗传多样性、复杂的免疫逃避机制以及披露靶点免疫原性差诸多困局。但最近的实验结果表明，saRNA/mRNA-LNP或铁蛋白纳米颗粒可以在转基因小鼠中诱导体细胞超突变到广泛中和抗体谱系。
此外，根据文献报道，mRNA疫苗在人偏肺病毒、副流感病毒、黄病毒、出血热病毒、狂犬病毒等病毒疫苗的研发中也都有进展。
3.2 细菌和寄生虫
抗生素耐药是一个巨大的医疗隐患，然而潜在疫苗靶点数量众多、非蛋白质疫苗靶点和高度抗原变异，细菌的疫苗开发极具挑战性。但最近的研究表明，mRNA疫苗似乎是适用于细菌的。有实验披露，编码四种结核抗原融合蛋白的saRNA-脂质无机纳米颗粒在小鼠中显示出一定程度的保护；使用伯氏疏螺旋体的外表面蛋白作为疫苗靶点开发的针对莱姆病的mRNA-LNP疫苗，可诱导强大的细胞和体液免疫反应，并保护小鼠免受细菌攻击（mRNA-1975/1982）；研究人员开发了一种针对艰难梭菌毒素和毒力因子的mRNA-LNP疫苗，这一多价疫苗在动物模型中引起了强大且长效的免疫反应。
致病性寄生虫是一组多样化的真核生物，然而由于真核细胞作为疫苗靶点的复杂性以及它们逃避先天性和适应性灭菌免疫反应的能力，所以针对这些病原体的疫苗开发很困难。但可喜的是，最近mRNA疫苗在寄生虫病的保护方面也取得诸多进展。例如，针对疟疾的mRNA候选疫苗已进入临床开发（BNT165b1）；一种编码疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子的saRNA疫苗，改善了对肝脏期和血液期疟原虫感染的控制。
04
mRNA疫苗的挑战与机遇
4.1 临床前模型的免疫原性与安全性限制
mRNA疫苗开发的一个普遍问题是临床前模型对人类免疫原性预测欠佳。如COVID-19 mRNA-LNP疫苗在小鼠中诱导强烈而持久的免疫反应，但在人类中的免疫反应和动力学却不是特别理想。这种现象，同样发生在流感/季节性流感mRNA疫苗中。非人灵长类动物(Non-human primates, NHP)模型似乎更好地反映了疫苗诱导的人类免疫反应。然而，它们价格昂贵使用存在伦理问题，并且某些情况下，由于NHP对某些感染是难以治愈的，因此无法评估疫苗诱导的保护作用。在人体中，mRNA-LNP疫苗可能会触发动物模型中未预测的全身炎症反应。这一问题主要由于物种之间先天免疫差异所引起。此外，人对许多病原体预先存在的免疫力和免疫激活的各种状态可能会影响反应原性，而这些也不能在动物中被模拟。
4.2 疫苗诱导所需免疫反应的局限
上呼吸道是呼吸道病毒的入口与传播场所，因此在病毒预防中即为重要（图4）。引发上呼吸道免疫的最直接方法是通过鼻内或口服给药，使疫苗安全有效地输送到粘膜表面。但是由于难以摄取和毒性差，目前大多数mRNA-LNP都不能实现高效黏膜递送。同时，LNP表面的PEG成分已被确定为脱靶抗体反应的罪魁祸首。但抗PEG抗体水平的增加可能会导致某些患者群体中使用的其他聚乙二醇化药物的清除速度更快，因此效果较差。因此，具有较低免疫原性的PEG替代品是mRNA-LNP平台研究的新方向。
图4 呼吸道病毒粘膜免疫机制图
4.3 多组分疫苗及其剂量方面的挑战
多价mRNA-LNP疫苗是近来研发的新趋势，但可能导致异聚化的问题。如当mRNA疫苗在同一细胞中表达多种不同SARS-CoV-2变体S蛋白时，可能会形成由来自不同变体组成的三聚体。而异源三聚体的形成会导致所得蛋白质的错误折叠，从而无法实际反映糖蛋白表面的中和或保护表位。此外，多价或多组分疫苗的另一个问题为，如果一种成分是主要免疫组分。则可能需要通过调整疫苗中不同mRNA的比例来克服，例如，降低编码显性成分的mRNA量。
剂量选择也是mRNA疫苗临床开发的一个重要方面。目前，50μg mRNA剂量似乎是当前人类预防性疫苗的耐受性上限，这代表了多价mRNA-LNP疫苗中包含的抗原成分的最大量。但在多价疫苗，如流感病毒4价mRNA-LNP候选疫苗（mRNA-1010），按平均值计算则每个构建体只能使用12.5 μg。目前，尚不清楚这些低剂量是否能在机体中诱导足够强大和持久的免疫反应。
4.4 短周期和低成本的显著优势
mRNA疫苗的一个关键优势是其灵活性，特别是对于需要频繁更新的疫苗。以流感病毒为例，基于病毒的灭活疫苗每年都会更新，以反映流行的毒株。每年根据监测和预测选择疫苗配方成分，疫苗的生产则大约需要6个月，经历如此长周期的研发，疫苗极大可能已与流行的毒株不匹配，从而对疫苗有效性产生重大负面影响。而mRNA疫苗已可在2个月甚至更短时间完成生产，将其应用于一直迭代的病毒株极具优势。
图5 mRNA疫苗生产的简单性
疫苗筛选时，一般会在几种候选药物中同时测试一种抗原的许多不同版本或病原体的许多不同抗原，以优选出最佳候选疫苗。但这同时伴随着巨额的研发经济成本和时间成本。mRNA疫苗好处在于，对于同一病毒可以突破抗原序列迭代的优势，使用相同的工艺进行生产，无需像其他疫苗一样对每种候选疫苗进行繁琐的工艺优化或靶抗原调整。未来，mRNA疫苗的这一显著优势，可能会使得表达多种不同蛋白且最佳靶点未知的病原体疫苗开发取得突破，比如结核病、疟原虫在内的不同寄生虫，甚至是具有大基因组和未知保护性抗原的DNA病毒，如非洲猪瘟病毒。而且mRNA-LNP整个制备过程无需使用真核细胞，这减少了外源因子的干扰。
05
总结
基于核苷修饰的mRNA-LNP制剂，近年来显示出巨大的前景。然而，基于RNA疫苗的全部潜力还远未实现，需要进一步优化以解决当前的局限性。因此，开发具有更高免疫原性、稳定性和更低反应原性以及具有诱导粘膜免疫反应能力的新型RNA疫苗是未来的优化方向。mRNA疫苗设计和制造的灵活性和易用性可能会彻底改变抗原选择和疫苗开发，并可能促使以前难以捉摸的病原体设计疫苗成为可能。对mRNA疫苗作用机制的更深入理解将指导下一代mRNA疫苗的设计。
参考文献
[1] Pardi N, Krammer F. mRNA vaccines for infectious diseases - advances, challenges and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2024 Nov;23(11):838-861. doi: 10.1038/s41573-024-01042-y.
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撰写| 工程菌星球
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice