张锋、姜凯议等揭示CRISPR-Cas系统控制蛋白酶

责编 | 酶美

CRISPR-Cas系统是原核生物防御外敌遗传元件侵袭的适应性免疫手段。目前已发现CRISPR-Cas系统gRNA靶向调控切割DNA或者RNA核酸酶；还发现有gRNA靶向调控的DNA转座酶【1，2】。除上述核酸操控加工的CRISPR系统外，还存在有一类是CRISPR系统控制的蛋白酶【3，4】。

隶属于Class I家族的Type III-E亚型效应蛋白Cas7-11是类特殊的CRISPR系统，系统内多效应亚基融合形成一个巨大的单亚基，命名为gRAMP（Giant Repeat Associated Mysterious Protein）。与gRAMP基因位点邻近有THP/CHAT蛋白酶（Csx29），可与gRAMP形成复合物。2022年8月25日，Science发表了可爱龙团队胡纯一博士领衔的研究论文，他们经过结构与功能详尽分析，揭示了Cas7-11通过gRNA靶向激活蛋白酶Csx29，Csx29蛋白酶对同样位于邻近的底物Csx30进行切割（请见：专家点评Science丨革命性新工具——sgRNA引导和RNA激活的蛋白酶系统）。

Csx30蛋白功能尚不清楚，其被切割后对生物的生理意义也不清楚。8月18和8月22日，bioRxiv预印本网站上，分别上传了日本东京大学Hiroshi Nishimasu、美国麻省理工大学 Jonathan S. Gootenberg团队合作题为RNA-triggered protein cleavage and cell death by the RNA-guided type III-E CRISPR-Cas nuclease-protease complex ，以及北京化工大学冯越教授与清华大学杨茂君教授合作题为Structural and functional insights into the type III-E CRISPR-Cas immunity 的两篇论文（Mol Cell | 冯越/杨茂君合作揭示III-E型CRISPR-Cas系统的免疫机制），该两篇论文不仅阐述了在gRNA激活蛋白酶Csx29并切割蛋白底物Csx30；并且这两篇论文都同时明确证实了Csx30切割之后会诱导细胞死亡。

2022年11月3日，Science再次发表了两篇关于Cas7-11系统的背靠背研究。来自东京大学Nishimasu实验室的Kazuki Kato、Sae Okazaki和来自麻省理工Gootenberg实验室的姜凯议、Schimidt-Ulms以共同一作发表名为 RNA-triggered protein cleavage and cell growth arrest by the type III-E CRISPR nuclease-protease 的文章。作者们首次揭示Cas7-11,CSX29, CSX30 和RPOE作为细菌免疫系统的作用。研究发现Cas7-11和Csx家族的蛋白形成gRNA激活的蛋白酶系统并且重新把此系统编程为人源细胞内可用的翻译后报告基因系统。来自Broad研究院的张锋/Strecker团队发表了研究：RNA-activated protein cleavage with a CRISPR-associated endopeptidase，论文对Cas7-11、crRNA激活Csx29蛋白酶活性的机制进行了结构与功能研究。研究还展示了Csx30被切割后，解除了对sigma因子的抑制，开放了一批新基因转录。利用这一体系，张团队开发了RNA检测体系。下面以Nishimasu-Gootenberg论文进行介绍。

III-E 型 CRISPR-Cas7-11 结合 CRISPR RNA (crRNA) 和蛋白酶 Csx29，并催化 crRNA 引导的 蛋白切割。Nishimasu和Gootenberg研究报告了带有和不带有靶 RNA 的 Cas7-11–crRNA–Csx29 复合物的低温电子显微镜结构，以及RNA结合诱导Csx29的构象变化。

作者们随后通过体外的生化实验揭示了 Csx29 对辅助蛋白 Csx30 的靶向 RNA 依赖性蛋白切割。细菌系统的重建表明，Csx30 裂解产生有毒蛋白质片段，导致生长停滞，这是由 Csx31 调节的。Csx30 结合 Csx31 和相关的 sigma 因子 RpoE会调控细胞生长速度，表明 Csx30 介导的 RpoE 抑制调节是细胞对感染的反应。

最后，作者们重新编程了 Cas7-11–Csx29–Csx30 系统，用于哺乳动物细胞中的可编程 RNA传感。利用人源细胞内高效的蛋白降解系统，Csx30作为可被切割的蛋白被置于荧光蛋白和降解蛋白 (DHFR) 的中间。作者证明此系统可以根据细胞内源RNA的存在等比切割带有降解子的荧光蛋白，以起到RNA传感的作用。

总体而言，作者证明Cas7-11–Csx29 效应器是一种 RNA 依赖性核酸酶-蛋白酶系统并且为细菌对抗噬菌体免疫系统的重要部分。此系统在转译后的蛋白级别进行计算，所以拥有检测癌细胞和特定细胞亚型的潜质。

CRISPR系统-蛋白酶多维度工作原理（来自张锋文章）

原文链接：

1. http://doi.org/10.1126/science.add7347

2. http://doi.org/10.1126/science.add7450

制版人：十一

参考文献

1. J. E. Peters, K. S. Makarova, S. Shmakov, E. V. Koonin, Recruitment of CRISPR-Cas systems by Tn7-like transposons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E7358–E7366 (2017).

2. G. Faure, S. A. Shmakov, W. X. Yan, D. R. Cheng, D. A. Scott, J. E. Peters, K. S. Makarova, E. V. Koonin, CRISPR-Cas in mobile genetic elements: Counter-defence and beyond. Nat. Rev. Microbiol. 17, 513–525 (2019).

3. K. S. Makarova, Y. I. Wolf, J. Iranzo, S. A. Shmakov, O. S. Alkhnbashi, S. J. J. Brouns, E. Charpentier, D. Cheng, D. H. Haft, P. Horvath, S. Moineau, F. J. M. Mojica, D. Scott, S. A. Shah, V. Siksnys, M. P. Terns, Č. Venclovas, M. F. White, A. F. Yakunin, W. Yan, F. Zhang, R. A. Garrett, R. Backofen, J. van der Oost, R. Barrangou, E. V. Koonin, Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: A burst of class 2 and derived variants. Nat. Rev. Microbiol. 18, 67–83 (2020).

4. S. A. Shmakov, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, K. V. Severinov, E. V. Koonin, Systematic prediction of genes functionally linked to CRISPR-Cas systems by gene neighborhood analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E5307–E5316 (2018).

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