国自然撰写：经典分子机制研究（一）
来源：医科苑
1. 概念介绍
转录水平的调控是真核生物基因表达调控中重要环节。真核细胞 RNA 聚合酶自身对启动子并无特殊亲和力，单独不能进行转录，也就是说基因是无活性的。因此，转录需要众多的转录因子和辅助转录因子形成复杂的转录装置。在基因转录起始阶段，通用转录因子协助 RNA 聚合酶与启动子结合，但其作用很弱，不能高效率地启动转录。只有在反式作用因子 (基因特异性转录因子）的协助下，RNA 聚合酶Ⅱ和 TFⅡ才能有效地形成转录起始复合物。
反式作用因子（trans acting factor）在转录调节中具有特殊的重要性。它是能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件 8～12bp 核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质。这类 DNA 结合蛋白有多种，能特异性识别这类蛋白的序列也有多种，正是不同的 DNA 结合蛋白与不同的识别序列之间的空间结构上的相互作用，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了复杂的基因转录调控机制的基础。
在真核生物中转录因子的调控是最重要，也是研究得最多的。蛋白质相互作用在转录因子活性的调控方面具有重要的意义。细胞内的反式作用因子都是处于有活性和无活性两种状态，这两种状态是可以转换的。
反式作用因子处于无活性状态时，与之相应的基因就不能表达；反式作用因子处于有活性状态、并与相应的顺式作用元件结合时，就可以促进 RNA 聚合酶和通用转录因子与相应的启动子结合，形成转录起始复合物。所以，真核基因的表达调控主要是调节反式作用因子的活性，随后反式作用因子调控基因的转录起始。
转录因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子，对基因转录发挥调控作用。大部分转录因子在激活以后与顺式作用元件结合，但也可能有一些转录因子是先结合 DNA，被激活后才发挥调节功能。增强子和上游启动子元件可以结合一些相同的蛋白质，在不同的基因中，存在着同样的顺式作用元件，这表明一些数量有限的基因调控蛋白控制着真核细胞的基因表达。
每一种转录因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但是转录因子对基因表达的调控不是由单一的因子完成的，而是几种因子组合，发挥特定的作用。通常是几种不同的转录因子控制一个基因的表达，一种转录因子也可以参与调控不同的基因表达调控。转录因子的数量是有限的，转录因子的组合作用方式使有限的转录因子可以调控不同的基因表达。
2. 研究思路
2.1 确定基因 B 启动子转录核心区域
2.1.1 扩增基因 B 上游启动子区
以基因 B 的转录起始位点为+1，扩增基因 B 启动子区（-1796bp 到+37bp），电泳结果显示条带特异，大小符合预期设计。接着用 DNA 回收试剂盒回收 PCR 所得扩增片段，用内部短引物鉴定 PCR 结果，电泳图显示这两对引物均扩增出位置正确的条带，＿bp 和＿bp，提示扩增的 1.8kbp 的片段确实为基因 B 启动子。用 DNA 回收试剂盒回收 PCR 产物得基因 B 启动子（-1796bp 到+37bp）扩增片段。
2.1.2 酶切 PCR 产物和 pGL3-Basic 质粒
因在基因 B 启动子扩增的引物的两端插入了 Nhe I 和 Hind III 酶切位点，故用 Nhe I 和 Hind III 限制性酶酶切后与 pGL3-promoter 载体上的 Nhe I 和 Hind III 粘性末端位点相连。
2.1.3 构建 pGL3-Basic-基因 BP（-1761/+37） 质粒 P（promoter）
将酶切的 PCR 产物连入 pGL3-Basic 质粒，经转化细菌后，挑取单克隆，用基因 B 启动子内部引物鉴定，挑取鉴定正确的克隆 1、2、3、4、5 送测序。用 Vector NTI 10.0（Invitrogen）软件对测序结果进行多序列比对。留取测序正确的菌株冻入-80℃ 保存。
2.1.4 不同长度的基因 B 启动子区的荧光素酶报告基因质粒的构建
用构建好的 pGL3-Basic-基因 BP（-1761/+37）为模板扩增不同长度的片段，按上述的步骤连入 pGL3-Basic 质粒，测序鉴定正确，-80℃ 保存。
2.1.5 双荧光素酶报告系统确定基因 B 启动子区核心区域
我们将成功构建的基因 B 启动子区的荧光素酶报告基因质粒共同转染 HEK-293 细胞，并同时转入 pRL-TK 载体作为内对照。48 小时后进行荧光素酶报告基因分析。如图所示：-1761、-1273、-1018、-644、-338、-217 六个不同长度的片段都能够启动基因 B 的转录，而-217 片段基本丧失转录活性，提示基因 B 的转录核心区域就位于这段序列中。
运用 TRANSFAC 转录因子预测网站我们发现在这 250bp 区域内含有 4 个转录因子 A 的结合位点。那么具体是哪个位点对基因 B 的转录起到关键的调控作用，然后我们又将这 250bp 的序列截成三部分，检测其荧光报告强度。结果显示当将-108 到-42 这段序列截掉后，基因 B 的转录活性基本丧失，这说明基因 B 的转录核心区域就位于在基因 B 启动子-108 到-42 内。这段区域决定了基因 B 约 70% 的转录活性。上述实验结果提示，转录因子 A 可能通过-108 到-42kb 这 60bp 之间序列激活基因 B 的启动子区转录活性。
注释：如上是寻找转录因子与基因结合位点的套路方案，通过截短不同区域寻找到活性关键区域。
2.2 转录因子 A 对基因 B 的转录调控作用
2.2.1 构建转录因子 A 真核表达载体
将编码转录因子 A 的基因序列连入真核表达载体 pcDNA3.1(+) 后经酶切鉴定，出现了＿bp 目的条带，结果与前期设计相符，证明在真核表达载体中插入了相应的转录因子 A 蛋白编码序列，命名为 pcDNA3.1-转录因子 A。
2.2.2 转录因子 A 上调基因 B 的转录表达
2.2.2.1 体外证实转录因子 A 结合基因 B 启动子
为了证明转录因子 A 可以结合到基因 B 启动子区的转录因子 A 结合位点，我们合成生物素标记的转录因子 A 结合位点的寡核苷酸探针，提取 cell-1 细胞的核蛋白，体外进行了 EMSA 实验。结果显示，加入核蛋白后可见明显的迁移条带，说明生物素探针可以和核蛋白结合，这种结合复合物可以被 100 倍未标记的探针所竞争而明显减弱。
同时我们也合成了突变转录因子 A 结合位点的生物素标记探针，突变探针将不会结合核蛋白，说明迁移条带确实是转录因子 A 和探针所形成的。为了进一步证实转录因子 A 的结合，超迁移实验显示加入转录因子 A 特异性抗体后，出现明显的超迁移带，但是加入无关抗体并不出现此条带。EMSA 实验证明转录因子 A 可以特异地结合到基因 B 启动子的转录因子 A 结合位点。
2.2.2.2 体内证实转录因子 A 结合基因 B 启动子
染色质免疫共沉淀（ChIP）检测的是 活细胞状态下转录因子和顺式作用元件的结合情况， 近几年来，该技术被广泛用于基因转录调控的研究。用 ChIP 的方法检测了基因 B 高表达的 cell-1 细胞和基因 B 低表达的 cell-2 细胞中转录因子 A 的结合情况。用转录因子 A 抗体沉淀交联复合体，然后经 RT-PCR 检测转录因子 A 在基因 B 启动子上的结合序列。
结果显示，加入转录因子 A 抗体后可以特异地沉淀基因组 DNA，通过 PCR 反应可以特异性扩增出基因 B 启动子上的目的片段，而加入 IgG 的阴性对照未扩增出相应条带。ChIP 实验结果在体内证实了转录因子 A 与基因 B 启动子区的结合。同时我们也发现在基因 B 高表达的 cell-1 细胞中转录因子 A 结合到基因 B 启动子的量明显高于基因 B 低表达的 cell-2 细胞。这也从另一个方面说明转录因子 A 结合到基因 B 启动子区，而且基因 B 的表达量越高其结合转录因子 A 的量也越高，转录因子 A 对基因 B 的表达调控可能起着上调的作用。
2.2.2.3 突变转录因子 A 结合位点显著下调基因 B 转录活性
为进一步验证转录因子 A 通过结合基因 B 启动子上-108 到-42 之间的转录因子 A 结合位点而激活基因 B 的转录表达，我们构建了转录因子 A 结合位点突变的基因 B 启动子荧光报告载体，同时转入 pRL-TK 载体作为内对照。转染 48 小时后进行荧光素酶报告基因分析。结果显示， 转录因子 A 结合位点突变的基因 B 启动子荧光报告载体的转录活性与对照相比显著下降， 这部分结果提示，转录因子 A 通过结合位于基因 B 启动子上-108 至-42 之间的转录因子 A 结合位点，进而激活基因 B 的转录表达。
2.3 转录因子 A 对基因 B 转录激活作用
将野生型的 pGL3-基因 BP（-108/+37）与转录因子 A 真核表达载体共转染，结果显示随着转录因子 A 质粒用量的增加，基因 B 启动子区的活性逐渐增强，呈现剂量依赖性。上述结果说明转录因子 A 可以结合到基因 B 启动子区并对其转录调控起着上调作用。
2.4 转录因子 A 参与基因 B 转录调控
为了进一步说明转录因子 A 在基因 B 转录调控中的生物学作用，我们运用 RNAi 技术在基因 B 高表达的 cell-1 细胞中下调转录因子 A 的表达，然后观察基因 B 的变化；反之在基因 B 低表达的 cell-2 细胞中通过瞬时转染转录因子 A 真核表达载体过表达转录因子 A，然后观察基因 B 的变化。通过 RT-PCR 和 Western blot 的分析，我们发现转入 RNA 干扰片段后转录因子 A 的 mRNA 和蛋白表达明显下降，同时基因 B 的 mRNA 和蛋白表达水平明显被封闭。反之，过表达转录因子 A 可以显著地升高基因 B 的表达水平。上述结果说明转录因子 A 参与基因 B 的转录调控，并且起着重要的作用。