天然多酚“化解”PD-1抑制剂耐药！科学家首次证实，卡姆果的单多酚能够通过肠菌，改善免疫治疗的疗效丨科学大发现

在遥远而神秘的南美洲大陆上，定居着一个名唤卡姆果的庞大家族，每个小卡姆果从出生起就处于紫外线强烈的恶劣环境中，“族中的智者”为了后代不再受活性氧的侵害，它们“身先士卒”，不断“摸索”后终于寻到了抗氧化的不二法门。

从此，“强迫”自己将体内一部分能量“练化”成多酚和维生素C成了小卡姆果们的必修课，而这也恰是整个家族抵御外界伤害的标志性武器。

原以为自此便能安稳度日，直到人类发现了它们家族的秘密……

近日，来自蒙特利尔大学研究中心的Bertrand Routy团队，针对如何调控肠道菌群来提高免疫检查点抑制剂（ICI）的治疗效果这一问题，在著名期刊Cancer discovery杂志上发表了重要研究成果[1]。

他们发现，从卡姆果提取出的栗木鞣花素通过与肠道菌群直接相互作用而具有抗肿瘤活性，不仅可以改变肿瘤免疫微环境，还能改善抗PD-1抗体 （αPD-1）治疗的效果。

论文首页截图

免疫检查点抑制剂的横空出世，直接将多种恶性肿瘤的总生存率拉高了一个水平[2-4]，然而，治疗耐药性仍然是其称霸抗癌圈的主要障碍。

目前所知的抵抗机制主要涉及以下几个因素：PD-L1表达上调、肿瘤免疫抑制微环境以及肿瘤突变负担[5-6]。而最近的宏基因组测序研究及无菌（GF）小鼠实验，揭示了肠道菌群也是决定癌症免疫治疗阈值的另一个关键点[7]。

于是，科学家们开始致力于研究如何操纵肠道菌群使之成为ICI的绝佳辅助，包括粪便微生物移植（FMT）、益生菌、针对性地调整饮食等策略[8-9]。

图片库说，这是卡姆果本尊

卡姆果（CC）是一种原产于亚马逊的浆果，含有多种植物化学物质，能增加肠道中嗜粘杆菌和双歧杆菌的丰度，对小鼠肥胖和代谢相关的紊乱具有保护性益生元作用[10]。所以，Bertrand Routy团队对卡姆果的益生元作用能否用来改变肠道菌群，从而提高抗肿瘤活性展开了研究。

首先，研究员们对口服卡姆果的抗癌效果进行了评估，他们分别构建了对ICI治疗敏感的小鼠MCA-205纤维肉瘤模型，以及对αPD-1治疗抵抗的E0771乳腺癌模型，腹腔注射αPD-1或PD-1同型抗体（IsoPD-1）治疗，同时，口服水或卡姆果作为联合治疗手段。他们发现，卡姆果与αPD-1联合治疗对两种肿瘤生长都表现出了显著的抑制作用，而其他疗法的效果则平平无奇。

αPD-1联合卡姆果对两种肿瘤生长的抑制效果

为了验证之前提出的假设—卡姆果的抗癌效果依赖于肠道菌群，他们设计了三种不同的方案：a)无菌小鼠，口服卡姆果；b)普通小鼠，口服广谱抗生素与卡姆果；c)普通小鼠，接受来自水或卡姆果治疗过的小鼠FMT。

结果显示，只有来自卡姆果组小鼠的FMT具有改善αPD-1治疗有效性的作用，这表明卡姆果的抗癌效果确实依赖于小鼠的肠道菌群。

卡姆果改善αPD-1治疗有效性的作用依赖于肠道菌群

那么，卡姆果具体是怎么影响肠道菌群的呢？

研究员们以肠道菌群的组成变化作为切入点，对MCA-205模型中四组小鼠的粪便样本进行了16S rRNA分析。扩增子序列变异（ASV）计数的结果表明，卡姆果治疗与alpha肠菌的多样性增加有关，而丰度分析则显示，与对照组相比，卡姆果组小鼠肠道内瘤胃球菌的比例明显增加。

肠道菌群组成与丰度变化分析

上述结果揭示了肠道菌群组成变化在卡姆果抗肿瘤活性中的桥梁作用，但是，从肠道菌群丰度变化到耐药肿瘤对αPD-1治疗重新敏感，真正架起这座桥梁并沟通二者的机制却未探明。

因此，研究员们接着对MCA-205纤维肉瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行了分析。他们发现，与对照组（水/IsoPD-1）相比，其他三组（卡姆果/IsoPD-1，卡姆果/αPD-1和水/PD-1）小鼠肿瘤内CD8+/Foxp3+CD4+ T细胞（Tregs）的比率有所提高，此外，卡姆果与αPD-1联合治疗显著增加了CD8+中央记忆T细胞（TCM）的比例。

MCA-205纤维肉瘤免疫微环境的分析

为了验证与卡姆果相关的抗肿瘤活性是由CD8+T细胞介导的，他们建立了小鼠MCA-205纤维肉瘤模型，在卡姆果与αPD-1联合治疗过程中使用抗CD8+单克隆抗体以清除CD8+T细胞亚群，并观察联合治疗效果的变化。

结果发现，与对照组卡姆果/CD8+同型抗体（IsoCD8+）相比，卡姆果/抗CD8+抗体（αCD8+）组小鼠的肿瘤体积明显增加，这说明卡姆果基于肠道菌群的抗肿瘤作用依赖于CD8+T细胞。

阻断CD8+T细胞亚群后小鼠的肿瘤体积生长曲线

卡姆果组成成分复杂，包括多种具有益生元特性的多酚类物质，研究人员试图采用高效液相色谱法（HPLC）鉴定出与调控肠道微生物有关的生物活性分子。

首先，根据分子极性，将卡姆果提取物粗略分为极性（P）、中极性（MP）、非极性（NP）以及不溶性组分（INS）四个组分；随后，如前述方法，分别给予荷瘤小鼠口服四种组分，并以卡姆果为阳性对照组，比较不同组分抑制肿瘤的效果，最后发现极性组的抗肿瘤活性与卡姆果不相上下。

卡姆果粗提成分的抗肿瘤活性

于是他们进一步细化极性组的成分，将其分成四个子组分：主要由抗坏血酸组成的P1部分，主要由多酚鞣剂和没食子酸组成的P2部分，由栗木鞣花素组成的P3部分以及由不同的复合多酚组成的P4部分。

以同样的方法评估上述四种子组分的抗肿瘤活性，发现P3是唯一一个与卡姆果具有类似抗肿瘤作用的组分，即栗木鞣花素可能是卡姆果通过调控肠道菌群而具有抗肿瘤活性的生物活性分子。

为了证实上述结论的可信性，研究员们仔细地分析了栗木鞣花素对肠道菌群的影响、抗肿瘤的作用机制以及对αPD-1治疗效果的改善情况。结果表明，栗木鞣花素的抗癌活性同样也依赖于肠道菌群的丰度增加，进一步分析小鼠的代谢物，他们推测，栗木鞣花素通过改变肠道微生物的组成进而对代谢表型产生了影响，比如小鼠肿瘤和血清中的牛磺胆酸含量增加。

栗木鞣花素治疗后小鼠的肿瘤生长曲线与代谢物分析

此外，接受栗木鞣花素治疗提高了小鼠肿瘤内CD8+/Foxp3+CD4+T细胞 （Tregs）比率以及TCM的浸润比例。

与卡姆果类似，栗木鞣花素可以有效解决αPD-1治疗的耐药性问题，并且呈现与瘤胃菌科丰度相关的剂量依赖性特征。

不同剂量栗木鞣花素对小鼠肿瘤体积与瘤胃球菌丰度的影响

为了进一步弄清楚栗木鞣花素与瘤胃球菌之间的相互作用，研究人员采用荧光素标记栗木鞣花素，通过流式细胞术和荧光显微镜发现，栗木鞣花素会优先与瘤胃球菌的细胞外被膜结合。

最后，研究人员利用无菌小鼠建立了MCA-205纤维肉瘤模型，分析发现，无论是抗肿瘤活性还是瘤胃球菌的丰度，单独口服瘤胃球菌或栗木鞣花素都没有明显的作用，只有联合使用才能将抗癌效果落实。

瘤胃球菌与栗木鞣花素对肿瘤抑制和瘤胃球菌丰度的影响

以上结果表明，栗木鞣花素经口服到达肠道后，会优先与瘤胃球菌的细胞外被膜结合，通过直接相互作用影响其丰度变化，进而促使代谢表型向有利于提高全身免疫应答的方向转化，这便是卡姆果具备抗肿瘤活性并能够改善ICI抵抗的原因。

总的来说，此项研究是首个证明单多酚作为益生元能够产生基于肠道菌群的抗肿瘤活性的成果，意义重大，为栗木鞣花素将来进入临床试验、成为癌症患者ICI治疗的辅助剂奠定了基础。

参考文献：

1.Messaoudene M, Pidgeon R, Richard C, et al. A natural polyphenol exerts antitumor activity and circumvents anti-PD-1 resistance through effects on the gut microbiota. Cancer Discov. 2022; candisc.0808.2021. doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0808

2.Gandhi L, Rodríguez-Abreu D, Gadgeel S, et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 2018;378(22):2078-2092. doi:10.1056/NEJMoa1801005

3.Motzer RJ, Tannir NM, McDermott DF, et al. Nivolumab plus Ipilimumab versus Sunitinib in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 2018;378(14):1277-1290. doi:10.1056/NEJMoa1712126

4.Elkrief A, Joubert P, Florescu M, Tehfe M, Blais N, Routy B. Therapeutic landscape of metastatic non-small-cell lung cancer in Canada in 2020. Curr Oncol. 2020;27(1):52-60. doi:10.3747/co.27.5953

5.Chen DS, Mellman I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 2017;541(7637):321-330. doi:10.1038/nature21349

6.Pitt JM, Vétizou M, Daillère R, et al. Resistance Mechanisms to Immune-Checkpoint Blockade in Cancer: Tumor-Intrinsic and -Extrinsic Factors. Immunity. 2016;44(6):1255-1269. doi:10.1016/j.immuni.2016.06.001

7.Routy B, Gopalakrishnan V, Daillère R, Zitvogel L, Wargo JA, Kroemer G. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nat Rev Clin Oncol. 2018;15(6):382-396. doi:10.1038/s41571-018-0006-2

8.Daillère R, Derosa L, Bonvalet M, et al. Trial watch : the gut microbiota as a tool to boost the clinical efficacy of anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 2020;9(1):1774298. Published 2020 Jun 3. doi:10.1080/2162402X.2020.1774298

9.Baruch EN, Youngster I, Ben-Betzalel G, et al. Fecal microbiota transplant promotes response in immunotherapy-refractory melanoma patients. Science. 2021;371(6529):602-609. doi:10.1126/science.abb5920

10. Anhê FF, Nachbar RT, Varin TV, et al. Treatment with camu camu (Myrciaria dubia) prevents obesity by altering the gut microbiota and increasing energy expenditure in diet-induced obese mice. Gut. 2019;68(3):453-464. doi:10.1136/gutjnl-2017-315565

责任编辑丨BioTalker