J. Future Foods | 刺五加苷E抑制肿瘤靶点及作用机制
Introduction
刺五加（Acanthopanax senticosus, AS）是东北常见的多年生落叶灌木。茎和果可制成AS酒和饮料，果实可榨油制成肥皂，嫩茎和叶是受欢迎的山菜，其他的叶可油炸加工成AS茶。此外，AS是一种常见的中药。AS已被用于治疗许多不同种类的疾病，包括风湿病、糖尿病和肝炎。此外，AS的抗肿瘤作用也得到了证实。AS含有多种化合物，如多糖、刺五加苷E (Eleutheroside E, EE)、皂苷B、槲皮素、金丝桃苷、异嗪地丁等。这些化合物已被成功地分离出来，并对其功能进行了研究。AS多糖、槲皮素和异沙比利丁已被证明可以抑制肿瘤的发展。目前的研究已经证实，EE通过增加胰岛素抵抗来调节糖代谢，改善小鼠的认知功能障碍。此外，EE还具有抗疲劳、抗氧化、免疫调节等作用。然而，EE的抗肿瘤活性尚未见报道。
一些研究证实，具有木质素结构的化合物具有抗癌、抗氧化和抗炎活性。Procumbenoside A, Justicidin A, Diphyllin, Tuberculatin是从原菇中提取的具有木质素结构的化合物，对Hep3B细胞具有较强的细胞毒性，并能抑制肿瘤坏死因子-α的产生。木质素结构化合物包括Machilin A, (−)-Sesamin C, Machilin G, (+)-Galbacin等，均具有抑制肺癌、结肠癌和乳腺癌增殖的作用。此外，也证实了磷脂酶Cγ1 (PLCγ1)是这些化合物在癌细胞中的靶标。从川芎中提取的一些呋喃木脂素结构化合物对肝癌细胞和宫颈癌HeLa细胞也有抑制作用。
作为一种具有木质素结构的化合物，EE的抗肿瘤活性有待进一步研究。以前的研究提出，它可能有抑制癌症的潜力，但没有进一步的证据。为了评价EE的抑癌能力和具体的抑癌机制，哈尔滨工业大学的Deyong Zeng、Yingchun Zhang*和Weihong Lu*等利用Swiss Target Prediction数据库、string数据库、DAVID数据库和TCGA数据库以及生存分析来证明EE的抑癌潜力。进一步确定其作用靶点和作用机制，并利用体外细胞实验进行验证。本研究首次为EE抑制肿瘤的可能性提供了理论依据。
Results and discussion
EE靶蛋白和靶蛋白相互作用
化学品与蛋白质和基因相互作用，在体内细胞和器官水平发挥其生理功能。基于这一理论，本研究使用瑞士靶标预测数据库预测EE的靶蛋白。在这项研究中，预测共有10 个受EE直接影响的靶蛋白（表1）。它们分为5 类，包括银蛋白偶联受体家族、胞浆蛋白、氧化还原酶、磷酸酶和转录因子。使用字符串数据库进行扩展和分析，共有414 种蛋白质，包括10个直接作用的靶蛋白，被确定与EE相关。
表1 与EE相互作用的蛋白质
为了评估EE介导的人体生物学功能，使用DAVID数据库进一步分析了目标蛋白。在DAVID数据库中，选择GAD\U DISEASE\U CLASS对目标蛋白的生物学功能进行初步评估（表2）。靶蛋白在癌症、药物基因组学、免疫、神经、心理、代谢和心血管疾病中显著富集。大多数蛋白质（238）在癌症中富集，表明EE可能在抑制肿瘤中发挥重要作用。
表2 靶蛋白作用的主要疾病
为了阐明EE在肿瘤抑制中的作用，搜索了GAD\U疾病定位靶蛋白的特定癌症类型。结果表明，靶蛋白主要分布在乳腺癌、肺癌、膀胱癌和前列腺癌中（图1）。这表明EE可能在这几种肿瘤细胞的抑制中发挥重要作用。
图1 靶蛋白在不同类型癌症中的分布
4 种不同类型癌症中的DEG
图2结果表明，BLCA共有3 924 个DEG，其中2 868 个上调DEG和1 056 个下调DEG（图2A）；LUAD的DEG为5 872，上调5 098，下调774（图2B），BLCA的DEG为3 587，上调2 442，下调1 145（图2C），PRAD的DEG为1 360，上调807，下调553（图2D）。
图2 BRCA（A）、LUAD（B）、BLCA（C）、PRAD（D）中DEGs的鉴定
交叉基因的鉴定
为了寻找EE抑制肿瘤的潜在靶点，考虑了4 种癌症中TGPs（与EE相互作用的蛋白质）和DEGs的交叉点。根据结果（图3），胰岛素和载脂蛋白A-II（ApoA II）存在于5 个部分中。胰岛素是一种合成代谢激素，协调体内葡萄糖的氧化或储存，调节全身代谢。目前的研究表明，高胰岛素血症与多种癌症的发生有关，包括乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、肝癌、食管癌、肾癌和胰腺癌。载脂蛋白aⅡ是高密度脂蛋白（HDL）的组成部分，在指导HDL脂质代谢的命运中起着重要作用。血清载脂蛋白a II被发现可以降低癌症患者的病情，是一种潜在的诊断生物标志物。
图3 TGPs和DEGs的交叉情况
功能补充
对所有共享基因进行KEGG功能富集。根据结果，一些癌症相关途径显著丰富（P<0.05，表3），包括癌症途径（hsa05200）、脂肪细胞因子信号途径（hsa04920）、hif-1信号途径（hsa04066）、AMPK信号途径（hsa04152）、FoxO信号途径（hsa04068）、糖酵解/糖异生（hsa00010）、Rap1信号途径（hsa04015）、胰岛素分泌（hsa04911），前列腺癌（hsa05215）、cGMP-PKG信号通路（hsa04022）、GnRH信号通路（hsa04912）、PI3K-Akt信号通路（hsa04151）、TRP通道的炎症介质调节（hsa04750）、胰岛素抵抗（hsa04931）。大多数重要途径与肿瘤的增殖和转移有关，这表明EE可能主要通过影响增殖和转移来影响肿瘤的进展。
表3 KEGG富集常见基因（P<0.05）
在BLCA、BRCA和LUAD中，葡萄糖代谢相关过程（GO:0045721、0042593）、DNA复制的正调节（GO:004574）和MAPK级联的正调节（GO:0043410）显著丰富（图4A-4C），表明EE可能通过糖代谢影响这3 种癌症。DNA的加速复制会损害癌细胞，DNA复制的正调控可能是EE影响这三种癌症的因素之一。此外，细胞增殖过程（GO:00016666、0008284、0001525）在BRCA中显著富集（图4B），表明EE可能影响BRCA的增殖过程。在PRAD中，脂质代谢过程（GO:0050995，0006656）和糖代谢过程（GO:0015758，0006006）显著丰富。
图4 共有基因GO功能富集分析
4 种癌症共有的基因的序列分析
为了探索共享基因之间的相互作用，使用STRING（所需的最小相互作用分数）进行了网络分析 = 0.4），并通过Cytoscape 3.5可视化网络（图5）。在BLCA中，PPI网络有26 个节点和43 个边缘，平均节点度为3.31（P<0.001，图5A）。在BRCA中，PPI网络有34 个节点和71 个边缘，平均节点度为4.18（P<0.001，图5B）。在LUAD中，PPI网络有31 个节点和62 个边缘，平均节点度为4.13（P<0.001，图5C）。在PRAD中，PPI网络有5 个节点和5 条边，平均节点度为2（P = 0.011，图5D）。在BLCA、BRCA和LUAD中，相互作用的共享基因可分为信号转导、基础代谢（胰岛素、脂质）和细胞周期三个功能簇。在BLCA中（图5A），INS、IL6、JUN、CDK1、ADCY5和PENK是连接这3 个功能集群的关键节点。在BRCA中（图5B），CDK1、INS、IL6、NPY是连接各种功能集群的关键节点。在LUAD中（图5C），INS、IL6、EGF、CDK1、NPY、ADCY8成为连接3 个功能簇的关键节点。此外，在4 种癌症中，INS始终处于网络的中心（图5），这表明INS可能是EE影响癌症的关键部位。
图5 建立4 种癌症共有的基因PPI网络
Kaplan-Meier生存估计
在BLCA中，5 个靶基因的低表达组的存活率高于高表达组，这表明这些基因的上调表达将加速BLCA的进展（图6A-6E）。在BLCA中，高表达组（GRM8、PTK6和RAD51）的存活率低于低表达组，这也表明这些基因的上调可能加速BRCA的进展（图6F-6H）。在LUAD中，在所有靶基因中，高表达组的存活率低于低表达组（图6I–6Q）。虽然仅将ADCY8确定为PRAD中可能的靶基因，但高表达组的存活率高于低表达组（图6R），这也意味着可以通过增加ADCY8的表达来改善PRAD。
图6 常见基因的Kaplan-Meier生存率估计
EE对BRCA的抑制作用
为了进一步验证实验结果，使用MTT法探索EE对MDA-MB-231乳腺癌细胞存活率的影响（图7）。结果表明，EE对MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖有抑制作用，这种抑制作用具有一定的量效关系（图7）。当EE浓度为50和100 μg/mL时，MDA-MB-231乳腺癌细胞的存活率没有显著影响，但当EE浓度达到200 μg/mL时，MDA-MB-231乳腺癌细胞的存活率为86.3%。当EE浓度继续增加至400 μg/mL时，MDA-MB-231乳腺癌细胞的存活率仅为72.67%（图7）。这些结果表明，EE对乳腺癌细胞的增殖有抑制作用。
图7 EE对MDA-MB-231增殖的影响
EE处理对BRCA细胞靶基因表达的影响
使用400 μg/mL浓度的EE抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞。培养48 h后，用qRT-PCR检测17 个预测靶基因的相对表达。令人惊讶的是，EE几乎下调了所有靶基因的表达（图8）。这与Kaplan-Meier生存率估计值一致（图6F-6H）。EE作用后，GRM8、PTK6和RAD51的表达分别下调33%、36%和38%。
图8 热图描述了用400 μg/mL EE抑制的MDA-MB-231乳腺癌细胞中17 个预测靶基因的相对表达
Conclusion
本研究提出了一个关于EE抑制癌症的靶点和机制的假设。ADCY2、ADCY5、JUN、LRRK2和PENK被认为是EE抑制BLCA的靶点。EE可降低其表达，激活mTOR和STAT3信号，抑制BLCA。EE通过下调GRM8、PTK6、RAD51的表达，激活STAT3/5、FAK、p130Cas、BKS、ERK/MAPK和PI3K/AKT等信号通路，抑制BRCA。对于LUAD，EE通过抑制DNA修复相关基因的表达来抑制癌细胞的增殖和转移。ADCY8被认为是EE抑制PRAD的靶点。EE上调ADCY8的表达，激活cAMP信号通路，达到抑制PRAD的作用。体外细胞实验表明，EE对乳腺癌细胞的增殖有抑制作用，qRT-PCR结果也表明了我们预测结果的准确性。
Identification of targets and mechanisms for Eleutheroside E in the treatment of cancer
Deyong Zenga,b,c,1, Yi Xionga,b,1, Yishu Yina,b, Shan Shana,b, Fangyuan Duana,b, Xin Gaoa,b, Chen Songa,b, Mengyao Liua,b, Yingchun Zhanga,b,*, Weihong Lua,b,c,*
a School of Medicine and Health, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China
b National and Local Joint Engineering Laboratory for Synthesis, Transformation and Separation of Extreme Environmental Nutrients, Harbin 150001, China
c Chongqing Research Institute, Harbin Institute of Technology, Chongqing 401135, China
*Corresponding author.
E-mail address: zyc229@163.com; lwh@hit.edu.cn
Abstract
Eleutheroside E (EE) is a monomer compound isolated from Acanthopanax senticosus, which has functions of antifatigue, antioxidation, and immune regulation. However, the function of EE in inhibiting cancer has rarely been reported. In this study, we used bioinformatics to determine the role and mechanisms of EE in inhibiting breast cancer (BRCA), prostate cancer (PRAD), lung cancer (LUAD), and bladder cancer (BLCA). Finally, the MTT method was used to evaluate the inhibitory effect of EE on breast cancer MDA-MB-231 cells, and the target genes were determined by qRT-PCR. The results showed that the survival rate of MDA-MB-231 cells was reduced by 27.33% after 400 μg/mL EE treatment. The results of qRT-PCR showed that EE down-regulated target genes in breast cancer cells, which was consistent with our predicted results. Moreover, our results indicated that EE may have impact on the transcription and translation of BLCA cells by targeting ADCY2, ADCY5 and JUN. In BRCA, we identified three targets for EE. In addition, EE affected DNA repair and the development of BRCA by affecting the expression of RAD51. In LUAD, we identified 9 targets for EE, 8 of which were related to DNA repair. EE inhibited PRAD by targeting ADCY8. Our research was the first report on the targets and mechanisms of EE for suppressing cancer combined with clinical data. Our research also provides theoretical support for using EE to suppress cancer.
Reference:
ZENG D Y, XIONG Y, YIN Y S, et al. Identification of targets and mechanisms for Eleutheroside E in the treatment of cancer[J]. Journal of Future Foods, 2022, 2(1): 68-81. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.03.019.
翻译/编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅
封面图片来源：图虫创意