J. Future Foods | 红景天提取物对秀丽隐杆线虫胰岛素抵抗的影响
Introduction
胰岛素抵抗（Insulin resistance）指机体对胰岛素的敏感度下降，导致葡萄糖摄取和利用受影响的一种病理状态。红景天（Rhodiola rosea L.）是一种广泛分布于我国的西藏、青海、云南等高寒地区的多年生草本植物，红景天和红景天苷很可能是通过对AMPK信号通路的调控，降低血糖水平，进而改善糖尿病及其并发症。秀丽隐杆线虫在糖尿病研究中是一个强有力模型生物，它具备使用简单、寿命相对较短、操作性强且成本低的特点。
广东海洋大学食品科技学院滕慧、陈雷教授等在本文以秀丽隐杆线虫为模型，探究红景天提取物干预对高糖培养的秀丽隐杆线虫体内氧化酶、活性氧积累水平、细胞凋亡产生的影响，从而评价红景天提取物EAE对秀丽隐杆线虫的胰岛素抵抗作用。再利用q-PCR技术测定红景天提取物对DAF-2、DAF-16、AKT-1、SKN-1、AAK-2、SOD-3基因表达水平的影响，进而明确红景天提取物对秀丽隐杆线虫胰岛素抵抗作用的分子机制。
Results and discussion
胰岛素信号分析
DR1564成虫、dauer虫外观差别明显，如图1所示，成虫身体较胖，头尾圆润，在显微镜下能够看到卵；dauer期线虫身体细长，游动速度快，在显微镜下能够很快分辨出来。
经过120 h的营救治疗，空白组和高糖模型组的成虫率无明显差异，说明高糖培养并未影响起到改善胰岛素强度的作用。低高剂量的EAE组与阳性对照二甲双胍和钒酸钠组成虫率与空白组相比均有程度不同的显著差异，以高剂量的EAEH组的治疗效果最佳，与空白组相比，成虫率提高了52.46%。这说明经过120 h药物的干预，有超过一半的秀丽隐杆线虫从dauer期被解救，且药物的干预效果与给药剂量成正相关。
葡萄糖水平测定
图2秀丽隐杆线虫体内葡萄糖含量
秀丽隐杆线虫在葡萄糖浓度40 mmol/L的NGM培养基下，体内的葡萄糖水平显著提高，这说明葡萄糖的添加极大提高了线虫体内葡萄糖含量。在给药干预后，能够明显观察到各组都表现出程度不同的降糖效果，低剂量EAEL组的效果与二甲双胍组的降糖效果基本一致，钒酸钠也表现出了较好的降糖效果，但都未能将葡萄糖含量恢复到正常水平。高剂量EAEH组的降糖能力最强，可将葡萄糖含量恢复到正常水平。
活性氧（ROS）水平测定
图3对秀丽隐杆线虫体内ROS水平的影响
高糖环境下促使线虫体内活性氧水平的大量累积，其中模型组的ROS水平是空白组的1.71 倍。在经过EAEL、EAEH、二甲双胍、钒酸钠药物治疗后，ROS水平均得到了显著的下降，但没有表现出剂量依赖性。
抗氧化酶（SOD、CAT）水平测定
图4 对秀丽隐杆线虫体内SOD(A)、CAT(B)、GSH-Px(C)、GSH(D)含量水平的影响
模型组、EAEL组、EAEH组、二甲双胍组、钒酸钠组在高糖环境下培养秀丽隐杆线虫体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性显著下降，没有起到一个良好的自由基清除效果。由此可以推断红景天乙酸乙酯萃取物降低线虫ROS水平的可能途径之一是超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性提高。
GSH-Px酶和GSH含量测定
谷胱甘肽（GSH）是由三个氨基酸分子组成的具有解毒作用的一种小分子肽，能够与自由基结合，将有害物质转为无害并排出体外。谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）作为氧化应激的标志物，能够催化GSH转化为GSSH，是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物酶。图6中，高糖环境下，GSH-Px的活性显著下降，经过给药干预后的GSH-Px水平相对于模型组皆有明显的提高，还原型GSH含量的增加。GSH-Px酶活降低导致GSH不能被及时催化，而使其含量呈现出一个明显的上升趋势，谷胱甘肽过氧化物酶活的降低和谷胱甘肽含量的提高也是导致线虫体内活性氧水平累积的重要因素。
线虫细胞凋亡
细胞凋亡是一种进化上保守的细胞自我毁灭程序，需要确保功能器官结构和维持组织稳态。在秀丽隐杆线虫中，吖啶橙染液能够透过细胞模与DNA结合，在显微镜下呈绿色荧光。而在凋亡细胞中，DNA被破碎分裂成大小不等的片段，也叫做凋亡小体，吖啶橙能使这些碎片在荧光显微镜下呈现致密的黄绿荧光。与空白组相比各组的相对荧光强度均存在较显著差异，说明高糖培养引起的氧化应激极大促进了细胞凋亡。与模型组相比，在给药120 h后，细胞凋亡均得到一定程度的延缓，但并不明显，只有高剂量的EAE组有显著区别，表现出一定的细胞凋亡保护作用。
图5 对秀丽隐杆线虫细胞凋亡的影响
DAF-2和DAF-16基因表达水平
图6 对秀丽隐杆线虫DAF-2（A）和DAF-16（B）基因表达的影响
胰岛素/IGF-1信号通路（IIS）通路控制着线虫的衰老，在线虫的寿命中发挥着至关重要的作用。在IIS通路中， DAF-2和DAF-16被广泛认为是影响线虫寿命的关键基因。与模型组相比，DAF-2、DAF-16基因的表达均出现了一定程度的上调。其中，EAEH、二甲双胍、钒酸钠表现出明显的DAF-2基因表达的上调。与模型组相比，给药干预后的DAF-16表达并无明显差异。仅有EAEH、二甲双胍组表现出不显著的上调趋势。可以推测红景天提取物可能会通过上调DAF-2、DAF-16基因的表达起到延长寿命的效果。且在对DAF-2的调控中起到明显的剂量依赖性。
AKT-1和SKN-1基因表达水平
SKN-1转录因子是一种进化上保守的外源性应激调节因子和促长寿因子，通过调节抗氧化酶相关基因的表达，减缓氧化应激带来的机体损伤。AKT是影响胰岛β细胞功能和胰岛素信号作用的重要因素，与葡萄糖的摄取、代谢息息相关。在AKT-1及SKN-1的基因表达中，模型组与空白组没有差异，低剂EAEL组呈明显下调，高剂量EAE、二甲双胍、钒酸钠都呈显著上调。因此，推测红景天提取物通过上调SKN-1、AKT-1表达提高胰岛素信号，促进能量代谢，以达到改善胰岛素抵抗的作用。
图7 对秀丽隐杆线虫AKT-1（A）和SKN-1（B）基因表达的影响
AAK-2和SOD-3基因表达水平
图8 对秀丽隐杆线虫AAK-2和SOD-3基因表达的影响
AAK-2是AMP活化蛋白激酶（AMPK）α亚基的秀丽隐杆线虫同源物，可调节细胞能量稳态并在抗压和延长寿命方面发挥作用。SOD-3作为秀丽线虫体内超氧化物歧化酶家族成员之一，与线虫的氧化损伤相关。EAEL、EAEH、二甲双胍显著上调AAK-2的表达。高糖引起了氧化应激导致SOD-3的表达普遍提高，给药干预后低剂量的EAEL组和钒酸钠组SOD-3表现为显著下调。这说明红景天提取物不是通过上调SOD-3的表达起到改善胰岛素抵抗作用，而有可能是通过提高AAK-2基因表达起到胰岛素抵抗的保护作用。
Conclusion
红景天提取物对DR1564线虫T2DM模型有一定的效果，提高其胰岛素信号，使线虫体内的葡萄糖水平显著下降至接近于人的空腹血糖值。经过红景天提取物给药120 h后，能够显著降低高糖培养使线虫体内ROS水平，GSH-Px的活性明显提高，同时降低GSH-Px酶活性，导致GSH未能及时被转化而在线虫体内大量累积。此外，红景天提取物能够降低高糖饮食下线虫细胞凋亡速率，也可通过上调DAF-2、DAF-16、AKT-1、SKN-1、AAK-2基因的表达，激活相关通路从而强化胰岛素信号、促进营养吸收及代谢、增强抗氧化能力，最终实现秀隐杆线虫胰岛素抵抗作用的改善。
第一作者简介
滕慧，女，韩国庆北大学食品科学与生物技术博士，广东海洋大学副教授、硕士生导师。主要研究内容：食品中天然抗氧化成分的高效提取及功能食品研发；食品加工过程中危害物的控制及营养组分变化；食品中生物活性成分的快速定性定量、分离纯化，及利用细胞模型和动物模型评价其生物有效性（降血糖，降血脂，抗炎症，防止氧化损伤等），建立活性成分与生物有效性的构效关系。以第一作者或通讯作者发表SCI论文30余篇。
通信作者简介
陈雷，男，韩国庆北大学农业生命科学博士，广东海洋大学教授、博士生导师，2021年广东海洋大学高层次引进人才，福建农林大学“校杰青”获得者。eFood期刊副主编，Frontiers in Pharmacology和Food Science and Human Wellness期刊编委，Oxidative Medicine and Cellular Longevity、Frontiers in Pharmacology和Canadian Journal of Gastroenterology and Hepatology专刊客座主编，担任“International association of dietetic nutrition and safety（IADNS）”秘书。主持国家自然科学基金面上项目、青年基金、中国博士后面上项目等5项，以第一或通讯作者发表的SCI/EI论文70余篇，其中一区论文30篇，IF＞10的10篇，高被引论文6篇，热点论文1篇，论文总被引>1500次（Elsevier），H-index=25。主要研究领域包括植物化学物质、功能营养物质的生物利用度。
Effects of Rhodiola rosea and its major compounds on insulin resistance in Caenorhabditis elegans
Hui Tenga, Hongting Denga, Yanzi Wub, Chang Zhanga, Chao Aia, Hui Caoa, Jianbo Xiaoa, Lei Chena,*
a Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Guangdong Province Engineering Laboratory for Marine Biological Products, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Seafood, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China
b College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Zhuzhou 350002, China
*Corresponding author.
E-mail address: chenlei841114@hotmail.com
Abstract
By establishing insulin resistance model of Caenorhabditis elegans, the effects of Rhodiola rosea extract and its compounds on glucose level, insulin signal intensity, antioxidant enzymes and cell apoptosis of C. elegans were investigated in present study. The mRNA expression of DAF-2, DAF-16, AkT-1, SKN-1, AAK-2 and SOD-3 were detected by qRT-PCR. The results revealed that R. rosea extract contain salidroside, kaempferol, chlorogenic acid, kaemphenol-7-O-glucoside, caffeic acid, and quercetin, etc. At the concentration of 200 μg/mL, R. rosea extract treated C. elegans showed increased insulin signal intensity by 52.46% compared with the normal group, while, glucose content decreased by 72.13% and reactive oxygen species (ROS) level decreased by 36.84%. Compared with high glucose model group, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) increased by 10.9, 14.2 and 27.9, respectively. After R. rosea extract intervention, the expression levels of DAF-2, AkT-1, AAK-2, SKN-1 and other genes significantly increased. These results also indicated that R. rosea extract could activate insulin receptor substrate (IRS) and adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase (AMPK) pathways to enhance insulin signaling, promote nutrient metabolism, and achieve the effect for improving insulin resistance of C. elegans.
Reference:
TENG H, DENG H T, WU Y Z, et al. Effects of Rhodiola rosea and its major compounds on insulin resistance in Caenorhabditis elegans[J]. Journal of Future Foods, 2022, 2(4): 365-371. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.08.008.
文章编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅
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