详解丨基因KO了，蛋白还残留？

构建基因敲除（KO）细胞时，明明DNA测序已经产生了移码的indel，但用Western Blot检测蛋白还是不理想，到底是什么问题呢？

图1 敲除前后，WB条带无差异

1. 首先考虑抗体特异性。

在评估基因过表达或干扰效果时，抗体能够检测到条带差异即可，对于非特异性条带的容忍度较高。然而，对于确认基因是否被完全敲除，非特异性条带的问题变得尤为关键。因此，采购抗体时注意查看该抗体是否经过KO验证。

2. 核查敲除方案可覆盖的基因转录本情况。

通过NCBI、ensemble或UCSC等数据库查看该基因转录本，核对敲除方案是否完全覆盖。如果有未覆盖的情况，转录本产物和WB条带是否能对应上？——尽可能采用片段敲除方案，覆盖更多转录本，在产生非3倍数indel的同时破坏基因更大的片段。

3.核查基因本底表达水平。

如果基因本底表达量很低，可能导致目标蛋白本身无法通过WB检测到，而WB结果上的条带均非目的条带，无法分析敲除前后的变化情况，影响结果判断。

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