中科院1区 Adv Sci | 揭示旋覆花内酯的胃癌铁死亡机制
在多种多样的去泛素酶中，泛素特异性蛋白酶 7 (USP7)，也称为疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶 (HAUSP)，属于最大的 USP DUB 家族。USP7与该胃癌GC的发生、进展、免疫反应和化疗耐药性相关。最近的一项研究表明，源自核糖体蛋白 S19 (circRPS19) 的环状 RNA 通过 USP7 介导的去泛素化上调己糖激酶 2 (HK2)，从而诱导 GC 细胞中的有氧糖酵解并促进 GC 进展。此外，USP7 在上游发挥作用，调节程序性死亡配体 1 (PD-L1)，这是一种参与癌症免疫抵抗和生长的蛋白质。靶向USP7可能会削弱PD-1和PD-L1之间的相互作用，使GC细胞对T细胞介导的杀伤敏感并增强抗肿瘤免疫力。在 GC 内的癌症相关成纤维细胞 (CAF) 中，USP7 去泛素化并稳定异质核核糖核蛋白 A1 (hnRNPA1)，促进 miR-522 包装到外泌体中。该过程导致 ALOX15 抑制并减少 GC 细胞中脂质-ROS 积累，最终导致化疗敏感性降低。然而，对 USP7 调节 GC 的机制（包括新底物和信号网络）的全面了解仍然难以实现。
2024年3月9日，中国科学院杭州医学研究所覃江江研究员、程向东研究员及上海中医药大学张卫东教授团队在Adv Sci （中科院1区，if14.3）在线发表了题为”Blocking Ubiquitin-Specific Protease 7 Induces Ferroptosis in Gastric Cancer via Targeting Stearoyl-CoA Desaturase“的文章。揭示旋复花内酯DHPO可靶向USP7降解硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD诱导的胃癌铁死亡。
摘要
胃癌（GC）对全球健康构成巨大挑战，传统疗法面临疗效局限性。泛素特异性蛋白酶7 （USP7）在胃癌的发生、免疫应答和化疗耐药中发挥重要作用，是一个很有前景的治疗靶点。多种USP7抑制剂在临床前研究中显示出选择性和疗效。然而，USP7的作用机制尚未完全阐明，目前也没有任何USP7抑制剂被批准用于临床。在本研究中，通过计算机模拟筛选，DHPO被确定为一种有效的用于胃癌治疗的USP7抑制剂。DHPO在体外具有显著的抗肿瘤活性，抑制细胞活力和克隆形成能力，阻止肿瘤的迁移和侵袭。体内研究使用原位胃肿瘤小鼠模型验证了DHPO抑制肿瘤生长和转移的功效，且无明显毒性。在机制上，抑制DHPO可触发铁死亡，这一点可通过线粒体改变、脂质活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）积累和铁过载得到证明。进一步的研究揭示了USP7通过去泛素化调节硬脂酰辅酶a去饱和酶（SCD），将USP7抑制与SCD降解和铁死亡诱导联系起来。综上所述，本研究确定了USP7是GC铁死亡的关键参与者，阐明了DHPO的抑制机制，并强调了其通过SCD调控诱导铁死亡的GC治疗潜力。
1.USP7 鉴定为 GC 致癌驱动因素
对来自 DepMap 数据集的 siRNA 和 CRISPR 数据进行了全面分析，特别关注 USP7。简而言之，从这些数据集中提取了 USP7 的依赖性得分，表明基因对细胞系生存至关重要的程度。-1 分表示完全基因组致死，而 0 分表示没有明显影响。我们的分析揭示了两个数据集中 GC 中 USP7 的显著富集（图 1A、B），强调了其与疾病的潜在相关性。随后，我们使用 CVCDAP（一个可公开访问的癌症信息学数据库）探索了人类 GC 组织中 USP7 丰度的变化。与正常胃组织相比，GC 组织中 USP7 的 mRNA 表达更高（图 1C）。为了评估 USP7 对 GC 细胞增殖的影响，我们计算了 TCGA、ACRG 和浙江队列中所有样本的 USP7 和 Ki-67（细胞增殖标志物）mRNA 表达之间的 Pearson 相关系数。值得注意的是，分析表明 USP7 和 Ki-67 在所有三个数据集中均呈正相关（图 1D）。总的来说， USP7 与 GC 中 Ki-67 表达的调节之间存在潜在的功能联系。此外，利用 128 名患者的内部队列探讨了 USP7 在 GC 中的临床相关性。采用组织微阵列 IHC，我们观察到 GC 组织中 USP7 相对于肿瘤旁组织的上调（图 1E）。此外，USP7的表达升高与GC的不良预后相关（图 1F）。这些观察结果强调了 USP7 在 GC 中的临床意义，并强调了其作为治疗靶点的潜力。
图1 USP7是胃癌（GC）的致癌驱动基因
2.基于结构的计算机模拟和GC细胞筛选确定了一种新型USP7抑制剂
鉴于目前美国食品药品监督管理局（FDA）尚未批准USP7抑制剂用于临床，我们努力寻找一种用于治疗GC的新型USP7抑制剂。在本文中，进行了基于计算机模拟结构的筛选，然后进行了细胞毒性GC细胞分析（图2A）。在计算机模拟中筛选了超过3000种化合物的库，以USP7的晶体结构作为活性位点环的主要构象。选取对接分数较好的化合物在0、1、10和100µM浓度下对MGC803细胞的细胞毒性。最后，一种被称为DHPO （2α，6α-二乙酰氧基-4β-羟基11-假愈木烯-12,8α-内酯，分子量= 366 g mol -1）的化合物（图2B）在两种筛选中均成为头号候选化合物，因为其可与USP7结合，并且在GC细胞中具有细胞毒性作用。根据计算模型，DHPO被预测位于USP7变构位点的间隙内。它的定位使其反应中心接近Cys300，而Cys300距离催化三联体约12 Å。催化三联体位于USP7催化域手掌、手指和拇指子域的界面（图2C）。这种排列通过迈克尔加成机制促进共价键的形成。重要的是，这种结合相互作用在空间上阻碍了泛素的结合，并阻止了USP7催化域中的α5螺旋向其活性构象的转变。DHPO和USP7的直接结合被一种称为MST的独立检测方法证实，在13.97µm的Kd下检测到稳健的结合曲线（图2D）。进一步评价所述化合物的抗gc活性。我们的结果表明，DHPO处理导致MGC803和MKN1细胞的细胞活力呈浓度依赖性降低（图2E）。在检测的最高浓度（25µm）下，72 h后细胞活力降低了95%以上。与对接模型一致，LC/MS分析显示DHPO与重组USP7蛋白结合。MALDI-TOF-MS显示，当与DHPO孵育时，野生型USP7蛋白的质量位移约为366 Da，这是由迈克尔加合物（Michael addition）引起（图2F），迈克尔加合物是DHPO的化学加合物的预测分子量。为了进一步鉴定对结合过程至关重要的残基，我们进行了MS分析，以检测DHPO体外修饰的半胱氨酸残基。覆盖Cys300（氨基酸294-301）的糜蛋白酶肽质谱分析显示质量增加了366，表明Cys300被DHPO烷基化（图2G）。综上所述，这些结果表明DHPO与GC细胞中具有催化作用的Cys300共价结合。
图2 新型USP7抑制剂DHPO的鉴定
3.DHPO在体内外抑制胃癌的生长和转移
为了进一步探索DHPO的抗gc效果，对MGC803细胞进行了RNA-seq分析，并鉴定了DHPO处理和未处理细胞之间的差异表达基因（Padj < 0.05, log2 fold change >1）。共有172个基因表达上调，266个基因表达下调。通路富集分析确定DHPO调控的潜在信号通路。分析发现，DEGs与细胞增殖相关通路（如Ras信号，PI3K-Akt信号，MAPK信号，AGE-RAGE信号），以及转移相关通路（包括Focal adhesion和Rap1信号）相关（图3A）。这些结果表明DHPO抑制胃癌细胞的生长和转移。如图3B所示，在克隆形成实验中，DHPO显著降低了GC细胞的克隆形成能力。与对照组相比，抑制剂处理的细胞集落数量和大小明显减少（图3B）。在伤口愈合实验中，与对照组相比，DHPO延迟了伤口的闭合（图3C）。同样，在transwell实验中，与对照组相比，DHPO处理的细胞显著降低了GC细胞的侵袭能力（图3D）。这些结果表明，USP7抑制剂DHPO在体外对胃癌细胞的致瘤潜能具有有效的抑制作用。
图3 USP7抑制剂DHPO在体外具有抗胃癌（GC）活性
4. USP7抑制剂DHPO在体内表现出抗癌效果，且不引起明显的宿主毒性
使用来自MGC803-Luc和MKN1-luc细胞系的原位肿瘤小鼠模型评估DHPO的体内疗效和毒性（图4A）。实验组包括溶媒对照组和DHPO（5和10 mg kg - 1）处理组。与溶剂对照组相比，dhpo处理组的肿瘤生长显著降低（P < 0.001）（图4B，C，E，F）。通过监测体重变化来评估毒性。与溶剂对照组相比，在任何剂量下DHPO处理均未引起体重的显著变化（图4D，G）。转移扩散是癌症的一个重要问题，尤其是胃癌，其转移通常发生在肝脏和腹膜。我们研究了DHPO治疗对肝、腹膜和脾转移的影响。结果表明，与溶剂对照组相比，5 mg kg - 1和10 mg kg - 1剂量的DHPO均有效抑制了脾脏和肝脏中的转移性肿瘤结节(图4H；图S2A，B，支持信息)。与溶剂对照组相比，对重要器官（包括肝、脾和肾）进行的组织学分析表明，两个dhpo处理组均无毒性或损伤迹象（图4I）。
图4 USP7抑制剂DHPO在体内表现出抗癌效果，且不引起明显的宿主毒性
5.USP7抑制剂DHPO诱导GC的铁死亡
为了深入研究DHPO在胃癌细胞中的作用机制，对DHPO或DMSO处理24 h的MGC803细胞进行了基于tmt的蛋白质组学研究。共有139个蛋白质显示出显著差异表达(≥1.3倍变化；P < 0.05);其中上调104个，下调35个。dhpo处理的MGC803细胞中差异表达的蛋白主要富集于铁死亡途径（图5A）。铁死亡以线粒体膜破坏、脂质过氧化、MDA蓄积和铁过载为特征透射电镜分析显示dhpo处理的NUGC4细胞中线粒体皱缩，膜密度增强（图5B）。与DMSO对照组相比，DHPO处理的MGC803和AZ521细胞中脂质ROS增加（图5C，D）。有趣的是，之前报道的USP7抑制剂FT671和P5091不影响脂质ROS（图5C，D）。为了特异性敲低MGC803细胞中USP7的表达，我们使用靶向USP7的siRNA（图5E）。值得注意的是，USP7敲低增加了脂质ROS的生成（图5F）。为了进一步验证这些发现，我们使用靶向USP7的shRNA下调AZ521细胞中的USP7表达（图5G）。至关重要的是，与对照细胞相比，USP7敲低细胞中的脂质ROS水平升高，并且这一效应在铁死亡抑制剂Fer-1的作用下可逆（图5H）。无论用DHPO、FT671或P5091处理MGC803和AZ521细胞，均观察到MDA含量累积（图5I）。在DHPO和FT671处理的AZ521细胞中观察到铁过载，但在P5091处理的细胞中未观察到铁过载（图5J）。在靶向USP7的shRNA感染的MGC803细胞中也观察到铁过载，Fer-1可逆转铁过载（图5K）。
图5 USP7抑制剂DHPO促进胃癌铁死亡
6.USP7通过去泛素化SCD来调节铁死亡，以响应DHPO处理
为了确定USP7调控铁死亡的潜在底物，研究了DHPO处理后下调的前10个蛋白，如图6A所示。在这些蛋白质中，SCD引起了我们的关注。SCD作为一种参与单不饱和脂肪酸生物合成的酶，在调节脂质过氧化和铁死亡中发挥重要作用。抑制或敲除SCD可增加脂质过氧化，使癌细胞对铁死亡敏感，而过表达SCD则可防止铁死亡现有文献报道，抑制SCD可降低胃癌细胞增殖，促进铁死亡这表明SCD可能是胃癌治疗的一个有前景的治疗靶点。Western blot和qRT-PCR检测USP7抑制剂DHPO对MGC803、HGC27和AGS细胞SCD表达的影响。DHPO处理24 h后，SCD蛋白水平在所有细胞系中均呈浓度依赖性降低（图6B），而SCD的mRNA表达在MGC803和AZ521细胞中呈浓度依赖性增加（图6C）。此外，当放线菌酮抑制新蛋白合成时，DHPO缩短了SCD蛋白的半衰期（图6D）。MG132阻碍了SCD蛋白的降解（图6E），证实USP7通过泛素化-蛋白酶体途径维持SCD蛋白的降解。基于这些发现，我们提出USP7通过将SCD去泛素化来调节铁死亡（图6F）。Co-IP验证了USP7和SCD之间的蛋白相互作用（图6G）。当使用靶向USP7的siRNA或shRNA敲低USP7时，SCD的表达水平降低（图6H，I）。与对照组相比，在MGC803细胞中敲低USP7使SCD蛋白的半衰期从5 h缩短至2.5 h（图6J，K），表明USP7参与了SCD蛋白的稳定。敲低USP7导致AZ521细胞中DHPO对SCD的抑制作用增强（图6L），进一步证实USP7是DHPO的作用靶点。此外，USP7敲低增加了与SCD结合的多聚泛素链，表明USP7调节SCD的去泛素化（图6M）。综上所述，我们的数据表明，通过DHPO抑制USP7可增加SCD的泛素化并加速其蛋白酶体降解。
图6 USP7抑制剂通过靶向假定的底物SCD诱导铁死亡
7. USP7通过增加SCD水平促进肿瘤发生，并被用作独立的预后生物标志物
与从原位肿瘤小鼠模型获得的结果一致，在GC PDX小鼠模型中，与对照组相比，两种剂量的DHPO处理均导致肿瘤重量显著降低（图7A）。还研究了DHPO对总生存率的影响。结果表明，与对照组和顺铂治疗组相比，DHPO治疗显著延长了生存期（图7B）。第36日时，对照组的所有小鼠均死亡，而USP7抑制剂治疗组超过一半的小鼠存活（图7B）。顺铂治疗组的生存率与对照组相似（图7B），这表明在该模型中，传统化疗药物对延长总生存期的作用有限。进一步分析显示，与对照组相比，USP7抑制剂处理组对体重无明显不良影响（P <0.05）（图7C）。相比之下，顺铂处理组的体重与其他各组相比显著下降（P <0.05）（图7C），这反映了众所周知的顺铂的细胞毒性作用。总体而言，我们的结果表明，5和10 mg kg - 1的DHPO治疗均能有效抑制肿瘤生长，而不会对重要器官造成显著毒性或损伤。4-HNE是脂质过氧化反应中含量最高的稳定终产物，具有高度毒性，与铁死亡有关IHC结果显示，与对照组相比，DHPO处理的小鼠肿瘤组织中4-HNE蛋白表达增加（图7E），证实了DHPO在体内诱导GC中的铁死亡。与体外GC细胞的结果一致，我们观察到USP7抑制后，通过Western blot（图7D）和IHC（图7E）， GC PDX肿瘤中SCD表达显著下调。这一发现表明，USP7抑制导致的SCD下调可能有助于体内肿瘤生长的抑制。为了进一步研究USP7和SCD在时间和空间上的致癌作用，我们使用了scRNA-seq队列[29]并鉴定了GC细胞群。令人惊讶的是，我们发现USP7和SCD在恶性细胞中均表现出高表达（图7F），进一步支持USP7和SCD是GC中的强效癌基因的观点。因此，DHPO似乎是一种潜在的更安全的替代或补充治疗GC的选择。这些信息对于开发有效的癌症疗法至关重要，这些疗法可以延长癌症患者的生存期并改善其生活质量。
图7 USP7-SCD轴与pdx荷瘤小鼠总生存期呈负相关
结论
综上所述，本研究提供了USP7通过抑制铁死亡作为胃癌治疗靶点的见解。这些发现为利用USP7降解和诱导铁死亡为GC治疗的潜在干预措施铺平了道路。
Guan X, Wang Y, Yu W, Wei Y, Lu Y, Dai E, Dong X, Zhao B, Hu C, Yuan L, Luan X, Miao K, Chen B, Cheng XD, Zhang W, Qin JJ. Blocking Ubiquitin-Specific Protease 7 Induces Ferroptosis in Gastric Cancer via Targeting Stearoyl-CoA Desaturase. Adv Sci (Weinh). 2024 May;11(18):e2307899. doi: 10.1002/advs.202307899.
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