大肠菌群、粪大肠、大肠埃希氏菌检验的相关知识

1、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌检验方法

1) 大肠菌群（colifoms）

一群在36°C培养48h可发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。

2) 粪大肠菌群（Fecal colifoms）

也称耐热大肠菌群。指大肠菌群中能在44.5C生长、发酵乳糖产生气体的一群细菌。

与大肠菌群一样，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。

食品卫生学意义：作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低。

作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系。

3) 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）

分类学概念：肠杆菌科、埃希氏菌属。是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。主要有：

■ O抗原(菌体抗原，150个)

■ K抗原(荚膜抗原，90个)

■ H抗原( 鞭毛抗原，50个)

4) 致泻性大肠埃希氏菌

能侵入肠粘膜上皮细胞,引起食物中毒的大肠埃希氏菌。产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)-肠胃炎、旅行性腹泻。

■ 致病性大肠埃希氏菌(EPEC) — 婴儿腹泻；

■ 肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)—出血性结肠炎；(O157∶H7；O104∶ H4；O111；O126等)

■ 侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)—杆菌性痢疾；

■ 粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)—急慢性腹泻。

2、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的关系

3、相关检验方法标准

■GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数

■GB 4789.38-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数

■GB 4789.39-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 粪大肠菌群计数

■GB 4789.6-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验

■GB 4789.36-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验

4、大肠菌群和粪大肠菌群的检测流程图

5、大肠菌群计数检验的操作

1) MPN法：

结果报告：根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表（MPN：最可能数，基于泊松分布的一种间接计数方法）

2) VRBA平板计数法

结果报告

经最后证实大肠菌群阳性的BGLB试管比例乘以VRBA菌落数再乘以稀释倍数，即为每克（毫升）样品中大肠菌群数。

如：稀释倍数10-3，吸取样品稀释液1mL平板典型或可疑菌落数100挑取10个典型或可疑菌落接种BGLB→阳性6管。

6、大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序

7、大肠埃希氏菌在EMB上的菌落形态

具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

8、靛基质试验(呵噪试验)(I)

■ 原理：某些细菌能分解蛋白质生成呵器，呵跺与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰呵噪红色化合物。

■ 培养基：色氨酸肉汤。

9、甲基红反应(MR)

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

■ 培养基：MR-VP培养基。

10、V-P试验(VP)

某些细菌在葡萄糖蛋白陈水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白陈中的肌基生成红色化合物，称V一P（+)反应。

36℃±1℃培养48h，加数滴甲基红溶液。

11、柠檬酸盐利用试验

有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。

12、大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别

■ 大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为﹢﹢﹣﹣或﹣﹢﹣﹣。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查 MPN 表（见附录B），报告每 g (mL）样品中大肠埃希氏菌 MPN 值。

13、大肠埃希氏菌平板计数法（第二法)

14、大肠埃希氏菌平板计数

1) 选取2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。

2) 将10 mL～15 mL冷至45℃±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 ℃±1℃培养18 h~24 h。

3) 选择菌落数在10 CFU～100 CFU之间的平板,暗室中360nm～366 nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。

4) 检验时用已知MUG阳性菌株做阳性和阴性对照。

18、大肠埃希氏菌平板计数的报告平板计数的报告

两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g(mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

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