二期免疫桥接三期疫苗临床试验 加速获得EUA应对变种株
●陈秀熙／台湾大学公共卫生学院预防医学与流行病学研究所教授●张金坚／台湾大学外科教授●许辰阳／台湾大学公共卫生学院公共卫生硕士学位学程兼任助理教授●陈立升／台北医学大学口腔医学院副院长
近日国产疫苗的解盲希望与契机，透过媒体以公开的方式，报导本次重要的临床第二期试验初步解盲结果，台湾民众得以接收第一手的临床试验科学讯息。
而疫苗研发过程中投注大量心血的政府单位、生物科技产业，研究单位，以及参与临床试验的医疗单位，能透过解盲过程向大众报导疫苗的研究设计、执行过程，以及研究结果，对于台湾国产疫苗未来在疫苗产业链，自主发展及供应产生一线曙光。
面对目前全球新冠肺炎疫情严峻下，如何免疫桥接第二期至第三期临床试验，以克服快速变种病毒变异，成为全球疫苗开发重要议题，加上日后国产疫苗欲能达到国际品质及认可，以协助全世界供应疫苗给第三世界国家，来及时控制疫情大流行。
为了更能够了解二期免疫桥接三期对疫情控制之意义及精神，本文以过去三期临床试验mRNA，载体及重组蛋白Novavax第一代疫苗为例，说明该疫苗第二期与第三期临床试验之不同，并以这些疫苗验证这第一代疫苗二期免疫桥接三期之科学实证，再论及疫苗为何要有第三期临床试验，才可达到符合国际认同的条件。
▲国产疫苗遭质疑未经「三期临床试验」。（图／记者蔡玟君摄）
WHO新冠肺炎疫苗开发二期桥接三期议题
世界卫生组织（WHO）于5月26日邀集世界各国的疫苗研发与管理专家，以及疫苗开发生产企业召开新冠肺炎疫苗保护效益评估会议。
会中以二期免疫原性桥接三期疫苗临床保护相关因子（Correlate of Protection，CoP）为主题，期望借由各国专家以及产业界的讨论，建立加速疫苗生产的共识。
标准的疫苗开发需由第二期临床试验以实验室方法，验证施打疫苗可以产生的中和抗体效价浓度后，进行第三期临床试验评估施打疫苗于人体，是否可降低感染症状个案与重症的临床效益。
为了在当前病毒快速变异的情境下控制全球疫情，WHO召开此会议目标在寻求以第二期临床试验的实验室结果，预测第三期临床试验的人体施打保护力效益，或称为二期免疫桥接三期疫苗临床试验评估。但会中各国对于此一评估方式仍有许多不同意见，其中以欧盟以及韩国外多数国家仍存有许多疑虑。
▲二期免疫桥接三期疫苗临床试验评估，是否可行争论不断。（示意图／翻摄国药集团）
二期疫苗免疫反应桥接三期临床试验
面对新冠肺炎病毒（SARS-CoV-2）不断发生变异株，各国提出第二代疫苗以及疫苗施打时，是否可以混合不同厂牌与种类等问题，若采用第三期临床试验进行评估则须追踪新冠肺炎感染，得病以及重症等临床事件终点才能提供科学实证（del Rio and Malani, 2021）。
为了更有效率的开发新疫苗并且兼顾疫苗效益的科学实证，运用第二期临床试验激发的人体保护性免疫反应结果来对于可能达到的临床保护力进行推测，以提供大规模使用紧急授权的科学佐证，就是所谓二期免疫桥接三期临床试验（Jin et al., 2021; Krammer 2021; WHO, 2013）。
▲接种疫苗。(图／路透)
目前对于新冠肺炎疫苗的保护性免疫反应主要着重于中和抗体浓度之评估，借由在第二期临床试验中比较疫苗引发的中和抗体浓度，与康复者血清可达到的抑制病毒侵袭浓度比较，预测疫苗可达到的临床保护力，就是前述所称二期免疫桥接三期临床保护力（Correlate of Protection ，CoP）。
就目前完成第三期临床试验的疫苗数据显示，个别疫苗第二期临床试验疫苗组，与康复者血清相较的中和抗体效价倍数，或可做为推测疫苗在第三期临床试验可达到效益之依据（Khoury et al., 2021）。
图一为此二期桥接三期床试验的设计与思维。在第二期临床试验的结果量测，研究可得到疫苗接种受试者、康复者血清，以及安慰剂组的中和抗体浓度。在实际应用中，此疫苗中和抗体血清浓度与康复者血清之反应倍数，或可做为预测第三期临床试验中可观察到的临床保护力（预测保护力，O圈），提供CoP证据。
▲图一、 二期免疫桥接三期临床试验。（图／撰稿团队提供）
此一预测保护力与实际进行第三期临床试验所观察到的保护力（实际保护力，实心圈）若相当接近，在发展新疫苗时，即可成为二期免疫桥接三期的评估替代终点。
图一列出第一代疫苗CoP之证据，若以重组蛋白Novavax疫苗为例，第二期临床试验之中和抗体血清效价（3906）为康复者血清（983）的3.97倍，所预测的临床保护力接近90%，与该疫苗第三期临床试验报导的施打效益达89%相去不远（Keech et al., 2020; del Rio and Malani, 2021; Khoury et al., 2021）。
mRNA疫苗莫德纳（mRNA-1273）与辉瑞（BNT162b2）在第二期临床试验之的中和抗体浓度，皆超过康复者血清4倍，预期保护力皆超过90%，也与第三期临床试验的效益接近（Khoury et al., 2021）。
▲辉瑞疫苗。（图／路透）
在此一科学证据下，疫苗组相较于康复者血清的中和抗体效价，可做为评估临床保护力的替代评估指标。以目前所解盲国产疫苗其中和抗体之效价反应，若能与康复者血清中和抗体效价比较，则可提供预测临床保护力CoP证据。
上述第一代疫苗桥接科学验证是否能应用于第二代疫苗，以二期免疫桥接三期临床试验，在科学界仍有诸多正反意见的讨论，需待国际间达成共识 （WHO, 2021），其争议点仍然在于二期及三期临床试验在临床保护力有效性之差别。
为能够了解此差别，以Novavax 疫苗为例，说明疫苗第二期临床试验以及第三期临床试验试计，及评估有效性目标之差异。
▲Novavax疫苗。（图／路透）
Novavax疫苗第一/二期临床试验
美国Novavax疫苗为重组SARS-CoV-2奈米颗粒疫苗，以全长三聚体SARS-CoV-2刺突蛋白及Matrix-M1佐剂组成。在第一/二期临床试验中，即利用随机分派比较不同剂量，及是否使用佐剂之免疫原性及安全性差异（Keech et al., 2020）。
该疫苗第一/二期临床试验于2020年5月26日开始进行并招募262名自愿者，经筛选131名合适者后进行随机分派为五组，除了安慰剂组外，疫苗组则搭配剂量高低与有无佐剂等不同四组。
研究设计如图二。第一/二期研究结果于同年9月2日发表，证实添加佐剂之疫苗组高低剂量可明显产生免疫抗原反应，施打第一剂后，免疫抗原反应与无症状新冠肺炎康复者血清抗体相近，施打第二剂后，免疫抗原反应甚至高出新冠肺炎门诊患者，并与住院患者相近。
然而佐剂加入后，使用高剂量（25μg）及低剂量（5μg）之结果并无差异。疫苗组所引发可抑制99%病毒（Inhibitory concentration, IC）的中和抗体（Neutralizing antibody）效价浓度几何平均数（Geometric mean，GMT，3906），与为康复血清数值（983）的3.97倍，疫苗造成的不良反应多数为轻度（Keech et al., 2020）。
在完成第二期临床试验后，Novavax疫苗于9月25日开始进行第三期临床试验，验证施打疫苗的临床效益。依据Novavax第二和第三期临床试验结果，施打两剂Novavax疫苗可有效对抗新冠肺炎病毒的感染，效力高达89.3%，在老年人和爱滋感染者这些免疫力相对较差的族群同样有效（Novavax, 2021; Rio and Malani, 2021）。
▲图二: Novavax疫苗第一/二期临床试验研究设计。（图／撰稿团队提供）
由于疫苗第二期临床试验中的主要目的，为评估人体是否可以透过疫苗，激发具有保护力的免疫反应，以及检视疫苗接种过程是否会对人体造成不良反应。为反应科学严谨度，利用随机分派研究设计（randomized controlled trial design）加上盲测是第二期临床试验的重要特征。
如图二在此研究设计中，参与者以随机的方式分派到疫苗组（接受疫苗施打）或安慰剂组（接受无效剂型如生理食盐水施打），配合盲性（blinding）的执行方式，接受疫苗施打的参与者（单盲，single blind）、疫苗施打者（双盲，double blind），以及评估分析者（三盲，triple blind），在研究分析进行时皆无法知道何人是接受疫苗或是无效剂。
随机分派过程使得日后在检视疫苗组与安慰剂组，所产生中和抗体与引发之不良反应时，可确保结果不受到如年龄、性别、病史等其他因子影响。
而盲性结合安慰剂组则可消除研究执行过程的公正，包含疫苗提供者与分析评估者在解盲（unblind）前提供给两组的处理及对待一致性，而两组的参与者在研究期间会影响结果健康行为，也不会因在不同组别而有所偏颇（Moher et al., 2010）造成偏差。
前述的Novavax疫苗第二期临床试验，即采用随机分派研究设计配合双盲进行评估。由于实际执行时的难度，疫苗组与安慰剂组通常采用1：1的方式进行。此外，第二期临床试验的主要目的，在评估是否可有效引发免疫反应，而非实际去检视施打疫苗后，是否真的可以减少感染新冠肺炎。
因此，国际间的研究报导，皆会用参与试验者在施打疫苗后的血清与康复者血清（Convalescent serum），比较疫苗引发的抗体效价，借此推论疫苗的免疫原性（immunogenicity）。
▲疫苗试验。（示意图／路透）
Novavax第三期临床试验
Novavax疫苗在完成第二期临床试验后，即于美国与墨西哥共119个收案点展开第三期临床试验。该研究共纳入29960位参与者，以2：1的比例将参与者随机分派至疫苗组与对照组，并于6月14日估公布期末报告。在三个月的观察期间内，疫苗接种组发生14位新冠肺炎个案而对照组则有63位（图三）。
疫苗接种组有14位新冠肺炎个案，皆为轻症。对照组中共有63位COVID-19个案，49位轻症，10位中度个案，以及4位重症个案。依据两组之COVID-19临床个案比较结果显示，Novavax疫苗对于新冠肺炎的临床保护力可达90.4% （95%信赖区间: 82.9-94.6%），对于中度及重症新冠肺炎临床保护力则达100% （95%信赖区间: 87.0-100%）。
▲图三、Novavax疫苗第三期临床试验研究设计。（图／撰稿团队提供）
临床随机分配试验学术标准（CONSORT）
关于疫苗第二期与第三期临床试验的设计，与主要评估目标整理如表一。而对于临床试验的设计、执行、评估，与报导的呈现，国际上也有一致的共识与报告准则检核表（Consolidated standards of reporting trials statement，CONSORT statement，Moher et al., 2010）。
为评估不同疫苗临床试验之品质，我们利用2013年规范临床研究倡仪组织（Standard Protocol Items: Recommendations for Interventional Trials, SPIRIT） 提出的临床试验检核表，搭配CONSORT statement进行检核。例如，俄罗斯载体疫苗在二期临床试验是非随机分派试验，相较于随机临床试验研究其临床症据强度较低、不严谨，因此就不适合对此试验做检核评分。
英国牛津、娇生载体疫苗，在检核评分中分别为78分及82分，而辉瑞、莫德纳的mRNA疫苗及Novavax所研发的重组蛋白疫苗，分别有高达82分、81分及81分的符合程度。试验越能完整符合随机分派之实验设计，及相关配合措施如有无盲测、资料管理、及监控等，则表示临床试验的品质与结果越具可信度，也更能做为临床使用授权审查的科学佐证。
表一也列出第三期临床试验与第二期临床试验，在安全性及有效性之不同，我们也可以同样CONSORT标准，来评估这些第一代疫苗科学严谨性。
▲表一、第二期与第三期临床试验设计与评估要点。（图／撰稿团队提供）
疫苗广泛使用前为何需要第三期临床试验？
在第二期临床试验完成疫苗免疫原性评估后，则须进入第三期临床试验，挑战疫苗在实际接种于大规模族群时的临床保护力。
虽然第二期临床试验可证实，疫苗能引起中和抗体等如同康复者一般的免疫反应，但疫苗是否可以达到保护接种者免于感染、产生症状、住院、重症，或死亡的临床保护力，则需要扩大纳入参与者，并利用随机分派与盲性设计的第三期临床试验，进行验证与评估。
除了上述的Novavax疫苗，近期德国的mRNA疫苗CureVac其疫苗组中和抗体效价与康复者之数值相近（皆为113），倍数为1，低于其他两个 mRNA疫苗而高于AZ载体疫苗。
但在纳入约40000名参与者的第三期临床试验初步结果显示，CureVac疫苗对于新冠肺炎的临床保护力却仅达47% （Dolgin, 2021）。此一结果显示，若以二期免疫桥接三期临床试验的临床保护力仍有其不确定性，仍需要第三期临床试验加以验证。
▲德国curevac疫苗。（图／翻摄自Facebook／curevac）
此外疫苗经验一期及二期临床试验后，能否安全及有效的接种于族群，仍有以下一些问题仍须在第三期临床试验回答，包含疫苗是否安全以及如何评估疫苗安全性？除了疫苗接种后的不良反应，还需要评估疫苗与抗体依赖性增强作用（ADE）与疫苗相关性增强呼吸道疾病（VAERD）等安全性问题。
所谓ADE，是指当疫苗接种于人体后，产生了中和抗体，而当此中和抗体跟病毒结合，反而保护不了而让病毒带入人体的免疫系统中，造成人体不但无法消灭病毒，还使得病毒大量繁殖。
而VAERD则是因疫苗产生之抗体无法中和病毒，反而使大量病毒与抗体产生免疫复合物，激活补体产生过敏发炎反应而使呼吸道病情加重，如表一所呈列，这些严重安全性问题，必须在大规模第三期临床试验才有可能验证。
▲三期疫苗临床试验相当重要。（示意图／记者汤兴汉摄）
疫苗临床试验紧急授权（EUA）与免疫桥接
由于疫情严峻，为了能够及早施打疫苗降低疫情，对于二期桥接三新疫苗或改良二代疫苗，在每个国家皆必须经过紧急授权（EUA）。
为因应变种病毒发展的第二代疫苗，欲以二期免疫桥接三期临床试验而予以紧急使用授权，依以上论述建议应能证实，疫苗所产生的中和抗体相较康复者中和抗体浓度倍数，提供临床保护力CoP预测的证据。更重要的是，必须检视疫苗在面对不同变种病毒株下，其中和抗体表现上是否仍能维持和原病毒株相等的保护力。
表二列举第一代疫苗在面对不同变种病毒时，其中和浓度表现相较于野生株或过去盛行的D614G病毒株的抗体浓度，均有不同程度的浓度下降情形，下降倍数越多代表该疫苗对抗该病毒的效益就会变得越差，表示必须进行疫苗改良品种。
同理可知，若第二代疫苗在二期对付某变种病毒的中和抗体，浓度表现一但有浓度下降的情形，而当该地区是盛行该变种病毒时，欲利用二期免疫桥接三期临床试验，在EUA上就必须非常小心。
▲表二、变种病毒对疫苗效益影响。（图／撰稿团队提供）
结论
疫苗开发中的第二期临床试验，主要是评估疫苗接种过程，是否会对人体造成不良反应，以及可否激发免疫反应与保护力，然而疫苗是否可以避免感染或重症，产生临床保护力，则需要扩大受试者，及利用第三期临床随机分派试验进行评估。
然而，面对全球新冠肺炎变种病毒快速变异与严峻疫情，为能加速第二代疫苗开发以及时控制疫情，使用第二期临床试验激发的人体保护性免疫反应（中和抗体）结果，与康复者血清中和抗体比较，特别在不同变种病毒下的保护力，对可能达到的临床保护力，进行推测以做为科学佐证，为提供紧急授权使用的权宜之计。
然而疫苗能否安全及有效的接种于族群，在国际间还未对二期免疫桥接三期临床试验有共识前，仍须依严谨的科学步骤及方法进行第三期临床试验，以符合实证科学的精神。
▲疫苗临床试验不可不慎。（示意图／路透社）
参考资料
Dolgin E. CureVac COVID vaccine let-down spotlights mRNA design challenges. 2021 Nature. https://www.nature.com/articles/d41586-021-01661-0.
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Khoury, David S., et al. "Neutralizing antibody levels are highly predictive of immune protection from symptomatic SARS-CoV-2 infection." Nature medicine （2021）: 1-7.
Keech, Cheryl, et al. "Phase 1–2 trial of a SARS-CoV-2 recombinant spike protein nanoparticle vaccine." New England Journal of Medicine 383.24 （2020）: 2320-2332.
Knipe, David M., et al. "Ensuring vaccine safety." Science 370.6522 （2020）: 1274-1275.Krammer, Florian. "Correlates of protection from SARS-CoV-2 infection." The Lancet 397.10283 （2021）: 1421-1423.
Moher, David et al. "CONONSORT 2010 Explanation and Elaboration: updated guidelines for reporting parallel group randomised trials." BMJ （2010）; 340.
Novavax "COVID-19 vaccine demonstrates 89.3% efficacy in U.K. phase 3 trial." January 28, 2021. https://ir.novavax.com/news-releases/newsrelease-details/novavax-covid-19-vaccinedemonstrates-893-efficacy-uk-phase-3
del Rio, Carlos, and Preeti Malani. "COVID-19 in 2021—Continuing Uncertainty." JAMA 325.14 （2021）: 1389-1390.
World Health Organization （WHO）. "Correlates of vaccine-induced protection: methods and implications." No. WHO/IVB/13.01., 2013.
World Health Organization （WHO） "COVID-19 vaccines: WHO meeting on correlates of protection" May 26, 2021. https://www.who.int/news-room/events/detail/2021/06/01/default-calendar/covid-19-vaccineswho-meeting-on-correlates-of-protection
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